周 阳， 袁少飞， 蒋廷亚， 韩邦兴， 高 力， 陈乃富

(1. 江苏大学 生命科学研究院， 镇江 212013；2. 皖西学院生物与制药工程学院 中药研究与开发工程技术研究中心， 六安 237012)

基因组靶向修饰技术研究进展

周 阳1， 袁少飞1， 蒋廷亚1， 韩邦兴2， 高 力1， 陈乃富2

(1. 江苏大学 生命科学研究院， 镇江 212013；2. 皖西学院生物与制药工程学院 中药研究与开发工程技术研究中心， 六安 237012)

基因组靶向修饰技术是研究基因功能的重要方法之一，该技术也被用于人类疾病的治疗上，从而成为近来生物学研究的热点。传统的靶向修饰技术由于其效率低、有毒性等缺点注定其将要被更高效、安全的技术所取代，因此产生了后来的三代基因组靶向修饰技术：锌指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9, CRISPR/Cas9)。这3种技术在克服传统技术缺陷的基础上，也针对其上一代技术的缺陷进行了自身的改善。对三代基因组靶向修饰技术，尤其最近发展起来的CRISPR/Cas9的结构组成、作用原理和基因定点修饰中的应用进行阐述，最后对三代基因组靶向修饰技术进行比较。

基因组靶向修饰； ZFN； TALEN； CRISPR/Cas9

传统的基因组靶向修饰技术主要依靠同源重组修复机制，即外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组，然而其打靶效率非常低，约为百万分之一，难以真正应用到实践中。传统技术缺点催生了新的基因组靶向修饰技术的产生，目前包括三代产物，第一代：锌指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)，第二代：类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)，第三代：常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9, CRISPR/Cas9)。其中，第一代和第二代都是一类人工核酸内切酶，由识别靶序列的结构域和非特异性的Fok I核酸内切酶结构域组成。ZFN依靠锌指蛋白来识别靶序列，TALEN则依靠TALE蛋白来识别，所以这两种技术的难点就在于识别靶序列元件的构建上。CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌中特有的一种针对外源性核酸入侵的免疫系统，通过小片段的RNA靶向定位入侵的核酸，然后由Cas9酶对入侵的核酸进行切割、降解[1]。相对于ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9突变效率高、构建简捷、成本低廉，被广泛应用。三代技术的修复机制都是通过非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组修复(Homologous recombination, HR)两种途径，从而实现基因靶向修饰。

1 锌指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)

1.1 锌指核酸酶的结构

ZFN由锌指蛋白(Zinc finger protein, ZFP)结构域和Fok I核酸内切酶切割结构域人工融合而成。ZFP由多个锌指(Zinc finger, ZF)基序串联而成，识别并结合特定的DNA序列，三个及以上锌指基序串联才能提高锌指蛋白的特异性。ZF通常由30个氨基酸残基组成，折叠形成了ββα的ZFP结构[2]。位于α螺旋区-1-+6 七个位点决定了ZF结合DNA序列的特异性，其中-1、+3和+6 三个位点氨基酸残基的突变可改变ZF识别的特异性，从而增加ZF识别的多样性[3]，这三个位点能特异性识别并结合DNA序列上3个连续的碱基(图1)。

图1 锌指蛋白结构示意图[4]

1.2 锌指核酸酶的作用原理

根据靶序列对两个锌指蛋白单体α螺旋上的3个可变氨基酸位点进行改造，获得能高表达的锌指蛋白。锌指蛋白依靠其α螺旋上的3个可变氨基酸位点分别特异性地识别并结合两侧3′到5′方向的DNA靶序列，当两侧锌指蛋白的靶位点反向排列并且间隔5～7 bp时，两单体的Fok I核酸内切酶二聚化，在靶位点切割造成双链断裂，从而激活细胞固有的DNA损伤修复机制(图2)。该机制主要有两种途径，即非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HR)。典型的NHEJ通常导致短基因在切割位点附近的插入或丢失，从而造成基因突变；然而在有外源DNA模板存在的情况下，一般会发生同源重组修复，HR修复会在切口处发生特定的基因的替换[5]。

图2 ZFN作用原理示意图[6]

1.3 锌指核酸酶的应用

ZFN是第一种成功构建的人工核酸酶。该技术经过10多年的发展已经颇有成果，模式生物-噬菌体、大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、拟南芥，无疑成为该技术应用的首选实验对象。如将ZFN mRNA注入斑马鱼单细胞期胚胎，将斑马鱼Ntl靶向敲除[7]；利用ZFN敲除小鼠Tbc1d，证明了该基因的损害会导致小鼠产生白内障和睾丸异常[8]。同时，以ZFN技术为基础的治疗研究部分已经进入临床试验阶段，如糖尿病、神经性疾病、AIDS和恶性脑胶质瘤的治疗[9]。

虽然ZFN技术在基因修饰上突变效率低、脱靶率高、对细胞有毒性，但其应用也不是完全没有价值，近年来有研究者利用ZFN技术进行科研，并取得理想实验效果。2014年Salabi F等[10]利用ZFN mRNA敲除绵羊的肌生成抑制蛋白(Myostatin, MSTN)单等位基因，观察敲除该基因对绵羊早期卫星细胞(Primary satellite cells, PSCs)增殖、分化的影响。利用ZFN技术对家畜进行基因修饰获得转基因家畜，尤其是家养猪，因为它与人类在遗传学、解剖学和生理学方面的相似性，使得它越来越多地被作为模型应用在人类医学上，如将猪用作异种器官移植、基础研究和人类疾病模型的建立[11]。

2 类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)

2.1 TALEN的结构

TALEN由TALE蛋白DNA结合结构域和Fok I核酸内切酶切割结构域人工融合而成。TALE蛋白家族来自于黄单胞杆菌，TALE蛋白一般包含有4个部分：N端是具有分泌信号功能的易位结构域(Translocation domain, TD)；中央区域是DNA结合结构域；C端是核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)和转录激活结构域(Activation domain, AD)。中央区域的DNA结合结构域是识别靶序列的位点，一般包含有1～33个长度约为34个氨基酸残基的串联重复序列和C端一个由20个氨基酸残基组成的半重复结构域[12]。其中，每一个重复序列模块中的第12和13位，称之为重复可变双氨基酸残基位点(Repeat variable diresidues, RVD)，RVD高度可变的氨基酸残基决定识别、结合DNA的特异性[13](图3)。

图3 转录激活因子样效应物DNA识别密码[13-14]

2.2 TALEN的作用原理

TALEN的结构中提到识别靶序列的决定性因素是每个重复单元中的RVD，不同的RVD可以特异性地识别A、T、C、G 4种碱基的一种或多种，其中最常见的与4种碱基相对应的4种RVD分别是NI(Asn Ile)-A、NG(Asn Gly)-T、HD(His Asp)-C 和NN(Asn Asn)-G、A，这样对靶序列的识别形成了对应的关系[14]。

TALEN能高效的发挥作用，除了RVD的改变外，TALEN靶位点的选择也很重要。2011年，Bogdanove和Voytas对TALEN靶位点的选择提出了几条原则[15]：1)TALEN单体结合的5′端的靶位点的0位应是T；2)5′端靶位点的第一位不是T；3)5′端靶位点的第二位不是A；4)靶位点的3′端是T结尾；5)靶位点中的4种碱基组成有一定的比例。后来随着高通量TALEN合成技术的发展，研究人员对TALEN的活性进行了大量的检测和比较后发现，TALEN靶位点选择只需要遵从：靶序列的5′端的0位置最好是核苷酸T[16]，这样更利于研究人员利用TALEN来开展研究工作。

首先保证靶序列的5′端0位置是核苷酸T，其次根据前述4种碱基与RVD间的配对关系，针对靶位点的碱基组成，设计相对应的TALE重复序列，然后TALE重复序列中发挥识别作用的RVD识别并结合DNA链上的目标靶点，通常是每个重复序列对应一个碱基；随后两单体FokI发生二聚化后发挥核酸内切酶活性，使DNA产生一个双链切口，从而引发机体自身的损伤修复机制-非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HR)，见图4。

图4 TALEN靶向切割的原理示意图[17]

2.3 TALEN的应用

TALEN蛋白首次报道被成功应用在酵母中[18]，之后TALEN技术又被成功应用在斑马鱼[19]、老鼠[20]及人类细胞[21]的基因组修饰上。在斑马鱼体细胞中靶向gria3a和hey2来检测TALE核酸酶的活性[19]；利用TALEN突变大鼠的IgM[20]；利用TALEN技术对肌营养不良蛋白基因进行突变，诱导产生多功能干细胞(iPSC)来治疗营养不良症[21]。

其潜在的实际应用也在农作物的改良[22]、家畜品型的改良以及人类疾病的治疗方面得到了广泛应用。如TALEN 靶向修饰人乳头瘤病毒基因来改善与人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)相关的宫颈恶性肿瘤[23]。

3 常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9, CRISPR/Cas 9)

3.1 CRISPR/Cas的基因座结构

CRISPR/Cas系统作为细菌和古细菌的一种适应性免疫防御机制而被熟知，细菌和古细菌依靠此系统防御入侵的病毒和质粒[24]，在消灭外来核酸同时，也将该外来核酸留在自身基因组中，当含有相同序列的外来核酸再次入侵时，机体能够识别，并对其进行切割，达到自我保护的目的，类似于免疫记忆。近年来，该系统已被重新目的化成为RNA导向的DNA靶向修饰工具，它能够产生RNA导向核酸酶，如Cas9快速高效的发挥修饰功能[25]，已在多种生物体中展现出了其作为基因组编辑工具的强大效力[26]，因而成为生物界的新宠。2013年以来，《Nature》、《Science》和《Cell》等国际顶尖杂志上刊登了许多CRISPR/Cas9相关论文。

CRISPR/Cas系统主要是由三个部分组成(图5)，分别是5′端的trans-activating crRNA(tracrRNA)；中间是众多Cas蛋白编码基因，这是一个多态性家族基因，包含了Cas9、Cas1、Cas2和Csn2，它们编码的蛋白主要具有DNA解旋酶、核酸酶、聚合酶等活性；3′端的CRISPR基因座，CRISPR基因座由前导序列(Leader)和多个短而高度保守的同向重复序列(Repeat)和多个长度不等的间隔序列(Spacer)组成，其中前导序列一般位于CRISPR基因座上游，是富含AT的非编码区域，重复序列一般长度为21～48 bp，含有回文序列，可形成发卡结构，各重复序列之间是间隔序列，长度为26～72 bp，是“俘获”和识别外来DNA的关键位点。

3.2 CRISPR/Cas的作用原理

CRISPR/Cas系统主要包含有3种类型[27]：TypeⅠ、Ⅱ、Ⅲ。Type Ⅰ分布在细菌和古细菌中，组分复杂；Type Ⅲ主要分布在古细菌中，在细菌中比较少见，因此这两种类型被研究的较少；同时Ⅱ型CRISPR/Cas系统由于组成相对简单，只使用单效应酶，如Cas9来切割双链DNA的独特特点[28]而被广泛应用于研究中。

在Ⅱ型系统中(图5)，首先是新的间隔序列的获得。外源核酸入侵时，Cas9蛋白通过前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motifs, PAM)信号识别原间隔序列，然后酶切产生前体间隔序列，最后将其整合到CRISPR重复序列中，这个过程伴随产生一个新的重复序列模块。其次是crRNA(CRISPR-derived RNA)的表达、加工和成熟，从CRISPR位点上先转录得到pre-crRNA，在pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的tracrRNA也转录出来，并激活Cas9和双链RNA特异性RNaseⅢ核酸酶对pre-crRNA进行加工，获得成熟的crRNA，它由一个间隔序列和部分重复序列组成[29]。

图5 CRISPR/Cas9系统结构和作用原理示意图[33]

加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合与crRNA互补的序列，然后DNA双链被解开，crRNA与互补链配对，另一条链保持游离的单链状态。Cas9至少含有两个活性位点，分别是氨基末端的类似于RuvC区域和蛋白质中部的HNH(或McrA-like)核酸酶区域，对应剪切crRNA的互补DNA链和非互补链，因此当DNA双链被解开后，由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链[30]，最终引入DNA双链断裂(Double-strand break, DSB)。

Cas9切割的位点位于crRNA互补序列邻近的PAM区。PAM通常临近靶序列3′端，它能被Cas9蛋白的单个域识别，其典型的结构组成是NGG，第一位可以是任何核苷酸，近来也有研究显示，PAM位点是打开DNA链和靶向切割所必须的[30-31]。为进一步简化操作过程，研究人员设计出了sgRNA(Single guide RNA)，它具有crRNA:tracerRNA复合物的功能，能够引导Cas9蛋白识别并结合于靶位点[32]。

3.3 CRISPR/Cas9系统的应用

CRISPR/Cas9系统在模式生物中的应用：产脓链球菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统被改造后，已经被成功的应用在植物[34]、小鼠胚胎干细胞[35]、小鼠[28]、人类细胞系[26]的基因组定点修饰中，从而可以防止生物体内有害基因的表达以及研究生物体内某些未知基因的功能。如人细胞系中非编码基因众多，但其功能知道的很少，利用CRISPR/Cas9敲除人细胞系中的非编码基因，如miR-21、miR-29a、lncRNA-21A等研究这些基因的功能[26]。

CRISPR/Cas9系统在疾病治疗中的应用：乳头瘤病毒16(Human papillomavirus 16, HPV16)被认为是人子宫颈癌发生的主要原因，一旦被HPV感染后，其中主要的肿瘤蛋白E6就会破坏宿主的肿瘤抑制蛋白p53，利用CRISPR/Cas9系统破坏HPV16的E6基因来治疗由HPV感染引起的恶性子宫颈瘤[36]。利用Cas9/gRNA编辑HIV-1的LTR U3结构域，从而抑制HIV病毒基因在其潜伏的神经胶质细胞、T细胞里的表达和复制[37]。Peng[38]等研究表明，与RNAi干扰相比，CRISPR/Cas9系统在功能丢失和获得方面都具有更高的效率和可靠性，因此利用CRISPR/Cas9将Livin(又称Melanoma inhibitor of apoptosisprotein/Kidney inhibitor of apoptosisprotein, ML-IAP/KIAP)敲除对治疗胃癌的临床效果更好。

CRISPR/Cas9在家畜育种中的应用：从克隆羊“多利”出生后，动物体上对转基因的应用可谓是产生了大的突破，但转基因育种由于其表达的可控性差、较难获得稳定的表型、生物安全性评估困难等缺点，其进展较缓慢，而CRISPR/Cas9系统对基因组定点修饰的高效性，使得其在家畜育种中有广阔的应用前景。

表1 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统特点的比较

4 小结

ZFN作为基因靶向修饰的第一代产物，存在的问题主要集中在两个方面，一是组装、筛选出高特异性的锌指蛋白，而这个过程复杂，且不易找到合适的识别位点(大概每500 bp才有一个潜在的靶位点)；二是FokI核酸内切酶的非特异性，会对非靶点进行切割，对细胞产生毒性。ZFN的不足促使研究者找到更完善的技术，随之产生了TALEN技术，TALEN具有比ZFN高的突变效率和低的脱靶现象，TALEN由于识别序列更长些，因此脱靶效率低，但这只是相对而言，TALEN的突变率和脱靶现象仍是需要解决的问题。

相比ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9技术切割DNA的效率更高，研究人员利用TALEN和CRISPR/Cas9两种技术将同一细胞的相同基因位点进行基因编辑后发现，CRISPR/Cas9的基因编辑效率要比TALEN高出大约10倍。在质粒构建上，CRISPR/Cas9技术具有设计简单、操作简便、成本低廉的优势。CRISPR/Cas9系统设计过程中，只需将靶基因sgRNA中由20个碱基组成的向导序列加以改变即可，这个操作由一步简单的分子克隆就能完成。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统特点的比较见(表1)。

CRISPR/Cas9由于其可靠、高效、快速的优点成为基因组靶向修饰的新宠，已被广泛应用，但该技术也存在应用难点：一是需要根据实验要求和sgRNA设计原则，设计出能具有较高特异性的sgRNA，并在后面的活性检测中具有较高的活性；二是Cas9的脱靶现象，虽研究证明并不存在脱靶现象，但不同物种间的差异并不能确切说明是否存在此现象；三是Cas9是细菌蛋白，它的表达是否会产生毒性也是有待于解决的问题。

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Research progress on the targeted genome modification

ZHOU Yang1, YUAN Shao-fei1, JIANG Ting-ya1,HANG Bang-xing2, GAO Li1, CHEN Nai-fu2

(1. Institute of Life Sciences, Jiangsu University, Zhenjiang 212013; 2. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Engineering Technology Research Center of Research and Development of Traditional Chinese Medicine, Lu'an 237012, China)

Targeted genome modification technology is one of the important methods to study genes′ function, which also can be used for the treatment of human diseases at the same time. It is becoming a hot field of biology research in recent years. Because of its low efficiency and toxicity, traditional targeted modification technology will be replaced by a more efficient and safer technology. Thus three generations of targeted genome modification technologies have been developed. It includes ZFN, TALEN and CRISPR/Cas9. These three techniques overcome the defects of traditional technology. Here, we discuss the research progress in the structure, mechanism and application of these three technologies, especially newly developed CRISPR/Cas9. Finally, the three generations of genome modification techniques are compared.

targeted genome modification; ZFN; TALEN; CRISPR/Cas9

2000-00-00；

2000-00-00

国家自然科学基金(31301919)；江苏省自然科学基金(BK20130506)；安徽省自然科学基金(1508085MH203)；安徽省高等学校省级自然科学基金项目(KJ2011A270、KJ2013A265)和江苏大学高级人才科研启动基金(1281330018)

周 阳，男，博士，助理研究员，主要从事神经退行性病变及金属离子的代谢，E-mail：zhouyang@ujs.edu.cn；

陈乃富，男，教授，硕士生导师，研究方向为生物资源开发与利用，E-mail：cnf505@126.com

Q78

A

2095-1736(2015)05-0070-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.05.070