包国凤，刁静静，井雪莲，张丽萍

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319；2.国家杂粮工程技术研究中心）

芸豆学名菜豆，是普通菜豆和多花菜豆之总称，属豆科菜豆属的小宗杂粮作物[1]。其营养丰富，据测定，每百克菜豆含蛋白质23.1克、脂肪1.3克、碳水化合物56.9克，蛋白质含量高于鸡肉[2]，因此芸豆蛋白质可作为食品中的营养添加剂。植物蛋白中营养价值最高的是清蛋白，其氨基酸种类多，同时具有良好的溶解性、起泡性和乳化性等功能特性[3]。传统食品加工中主要利用动物蛋白如鸡蛋、牛乳等提高蛋糕、面包和冰淇淋等食品的品质[4]。然而，动物蛋白价格高，且资源有限，因此，开发植物优质蛋白具有重要的现实意义。

芸豆清蛋白富含谷氨酸、亮氨酸、天门冬氨酸等，具有极高的营养价值和功能价值[5]。如果将芸豆清蛋白分离出来，可用于香肠、面包、冰淇淋等食品中，将会为蛋白源提供极好的补充。目前碱溶酸沉法提取的芸豆蛋白是总蛋白，其中包含了清蛋白组分。如果采用水浸提法可将芸豆中的清蛋白分离提取出来，通常采用的水浸提法是用自来水或纯净水。目前有报道使用小分子团磁化水提取动植物多糖的研究，水在磁场中以一定速度沿垂直磁力线方向流动并被磁化，其表面张力系数、黏度、密度、电导率、pH值等均发生变化，因此具有较强的穿透细胞、代谢物质的能力[6]。由于小分子团磁化水进出细胞能力强，使得提取的物质溶出量大，具有提高提取率的特点，因此，针对的小分子团磁化水提取芸豆清蛋白的工艺参数进行试验，为高效提取芸豆清蛋白提供技术参考。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

芸豆（垦芸2号），市售；低分子量蛋白Marker，中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；

硫酸铜，硫酸钾，浓硫酸，氢氧化钠，硼酸，盐酸，甲基红，亚甲基蓝，自来水，纯净水，冰乙酸，氯化钠，Tris，Bis，SDS，巯基乙醇，溴酚蓝，考马斯亮蓝，甲醇，以上均为市售分析纯；小分子团磁化水，自制。

1.2 仪器设备

SKDA-800型自动凯氏定氮仪：上海沛欧分析仪器有限公司；Coolsafe TM 55 110-4L/55-9L冷冻干燥机：环球分析测试仪器有限公司；LD4-40型低速大容量离心机：北京京立离心机有限公司；STS-2A型水平脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司；Mini Protean3Cell型垂直电泳电泳槽，Powerpac Universal电泳仪：BIO-RAD美国伯乐；Gel-Pro Imager Kit型电泳凝胶成像系统：美国Media Cybernetics公司。

2 试验方法

2.1 芸豆清蛋白提取的工艺路线

2.2 工艺操作要点

2.2.1 芸豆粉碎

挑选干净、除杂后的垦芸2号芸豆，利用高速粉碎机粉碎。

2.2.2 过筛

取粉碎后的芸豆干粉过不同孔径筛网。

2.2.3 浸提

取过筛后的芸豆干粉10 g放置于烧杯中，按一定液料比加入提取液，在一定温度、一定时间下均匀搅拌。

2.2.4 离心

将浸提液3 200 rpm离心15 min，将上清液用200目滤布过滤除杂。

2.2.5 等电点沉淀

将0.1 mol·L-1盐酸缓缓加入到上清液中，调pH至4.5，静置2 h，待明显分层后离心，再用氢氧化钠将离心底物调至中性。

2.2.6 冷冻干燥制粉

利用冷冻干燥设备将酸沉离心后的沉淀冷冻干燥制粉，测定蛋白质含量，计算提取率。

2.3 芸豆清蛋白含量的测定与提取率的计算

采用GB 5009.5-2010凯氏定氮法测定提取物中芸豆清蛋白含量，称量利用恒温干燥箱干燥后的芸豆清蛋白提取物，计算芸豆清蛋白提取率。每组试验设三个平行样，取平均值，计算方法如下：

2.4 单因素试验

用小分子团磁化水、自来水和纯净水为蛋白提取溶剂，选择提取时间、提取温度、液料比和粉碎粒度为影响清蛋白提取率的影响因子，研究不同因素对清蛋白提取率的影响效果。

2.4.1 不同处理水在不同提取温度下的芸豆清蛋白提取率试验

设提取温度分别为25、30、35、40和45℃，其他条件不变，采用2.2工艺及参数，以2.3为指标计算不同处理水在不同提取温度下的芸豆清蛋白提取率。

2.4.2 不同处理水在不同提取时间下的芸豆清蛋白提取率试验

设提取时间分别为1、1.5、2、2.5和3 h，其他条件不变，采用2.2工艺及参数，以2.3为指标计算不同处理水在不同提取温度下的芸豆清蛋白提取率。

2.4.3 不同处理水在不同液料比时的芸豆清蛋白提取率试验

设液料比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，其他条件不变，采用2.2工艺及参数，以2.3为指标计算不同处理水在不同提取温度下的芸豆清蛋白提取率。

2.4.4 不同处理水在不同粉碎粒度时的芸豆清蛋白提取率试验

设粉碎粒度分别为20、40、60、80和100目，其他条件不变，采用2.2工艺及参数，以2.3为指标计算不同处理水在不同提取温度下的芸豆清蛋白提取率。

2.5 芸豆清蛋白提取技术参数优化试验设计

根据单因素试验结果，选取其中提取率最高的一种溶剂作为技术参数优化的试验数据，设其提取温度（X1）、提取时间（X2）、液料比（X3）、粉碎粒度（X4）为自变量，以芸豆蛋白提取率为因变量，采用Design-Expert.V8.0软件设计三因素五水平回归组合试验实验设计见表1。

表1 试验设计的因素和水平编码表Table 1 Factors of test design and level of coding TAB

2.6 数据分析

所有实验平行重复3次，取平均值，采用Design-Expert.V8.0软件进行数据分析。

2.7 芸豆清蛋白电泳表征

采用NY/T1663-2008行业标准聚丙烯酰胺凝胶电泳法，取芸豆清蛋白粉加尿素溶解，添加溴酚蓝煮沸2～3 min后，取20 μL点样，采用5%的浓缩胶和12%分离胶进行垂直电泳，条件为80 V、15 A，电泳至浓缩胶与分离胶临界线，再调至120 V、30 A，电泳至染色液最底处，电泳后用0.1%W·V-1考马斯亮蓝R250在摇床作用下染色三小时，最后用乙醇冰乙酸脱色，每两小时换一次脱色液，直至背景透明，最后利用电泳凝胶成像系统成像，计算芸豆清蛋白分子量。

以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白迁移率，计算蛋白分子量。

3 结果与分析

3.1 不同处理水在不同提取温度下对芸豆清蛋白提取率的影响

图1是提取时间2 h、液料比20∶1、粉碎粒度60目时，不同处理水在不同提取温度下的芸豆清蛋白提取率。

图1 不同处理水在不同提取温度下对芸豆清蛋白提取率的影响Fig.1 Effects of treated water on albumin extraction rate of kidney bean at different temperature

由图1结果可知，当提取温度为30℃时，小分子团磁化水、自来水与纯净水提取芸豆清蛋白的提取均率最高，但其中小分子团磁化水的提取率最高。35℃后开始下降，差异性分析表明，提取温度为30℃与35℃的两个处理量提取率差异显著（P＜0.05），因此30℃较为合适[7]。

3.2 不同处理水在不同提取时间下对芸豆清蛋白提取率的影响

图2是提取温度30℃、液料比20∶1、粉碎粒度60目时，不同处理水在不同提取时间下的芸豆清蛋白提取率。

图2 不同处理水在不同提取时间下对芸豆清蛋白提取率的影响Fig.2 Effects of treated water on albumin extraction rate of kidney bean at different time

由图2结果可知，当提取时间为2 h时，小分子团磁化水提取芸豆清蛋白的提取率最高，2.5 h后开始下降。这与周大寨的研究结果相同[8]，即提取芸豆蛋白的过程中，由于提取时间过长，芸豆中的酶类也渐渐溶出，起到了水解蛋白的作用，从而导致芸豆清蛋白的水解，芸豆清蛋白的含量渐渐降低，计算的提取率的也出现降低现象。

3.3 不同处理水在不同液料比下对芸豆清蛋白提取率的影响

图3是提取温度30℃、提取时间2 h、粉碎粒度60目时，不同处理水在不同液料比下的芸豆清蛋白提取率。

图3 不同处理水在不同液料比下对芸豆清蛋白提取率的影响Fig.3 Effects of treated water on albumin extraction rate of kidney bean at different solid-liquid rate

由图3结果可知，随着液料比的增大芸豆清蛋白的提取率逐渐升高，当液料比为20∶1时，芸豆清蛋白的提取率呈增长趋势不明显，造成这种状况的原因是液料比较小时，水分不足，芸豆粉不能完全溶于水中，物料分散不均匀，使得清蛋白没有完全溶出。当液料比达到20∶1时，处理水充足，芸豆粉能够完全溶于水中。差异性分析表明，液料比20∶1与25∶1两个处理量差异不显著（P＞0.05），且液料比越高生产成本也越大，过大的液料比会降低蛋白质提取液浓度，延长后续操作时间，综合考虑液料比为20∶1较为合适。

3.4 不同处理水在不同粉碎粒度下对芸豆清蛋白提取率的影响

图4是提取温度30℃、提取时间2 h、液料比20∶1时，不同处理水在不同粉碎粒度下的芸豆清蛋白提取率。

图4 不同处理水在不同粉碎粒度下对芸豆清蛋白提取率的影响Fig.4 Effects of treated water on albumin extraction rate of kidney bean at different crushing fineness

由图4结果可知，随着粉碎粒度的减小芸豆清蛋白的提取率逐渐升高，当粉碎粒度为60目以上时，芸豆清蛋白的提取率呈增长趋势不明显。差异性分析表明，粉碎粒度60目与80目两个处理量差异不显著（P＞0.05），故选取粉碎粒度为60目较合适。

由以上四个单因素试验分别可以看出，提取温度、提取时间、液料比、粉碎粒度四个因素对芸豆清蛋白提取率都有很大的影响，从图1～4均可以看出小分子团磁化水作为处理水提取芸豆清蛋白有效的提高了清蛋白的提取率，这是因为水经过磁化处理后，由于水分子之间的氢键断裂，形成小分子团水，具有渗透力强，溶解力强的特点，能增加水的生物膜透过率，能够将更多的蛋白溶解出来[9-10]，因此大大提高了清蛋白的提取率。

3.5 小分子团磁化水提取芸豆清蛋白的工艺参数优化结果

3.5.1 试验模型的建立与分析

根据上述的单因素实验结果，采用四因素五水平二次回归正交旋转组合法，利用Design-Expert.V8.0软件对实验数据进行多元回归拟合。分析提取温度、提取时间、液料比和粉碎粒度对芸豆清蛋白提取率的影响，见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiments

续表2 响应面试验设计及结果

通过软件对表的实验数据进行二次多项回归拟合，得到提取温度（X1）、提取时间（X2）、液料比（X3）和粉碎粒度（X4）对芸豆清蛋白提取率（Y）二次多项回归模型方程：

回归模型方差分析见表3。

表3 回归方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可以看出，模型的F1=39.18，P＜0.000 1，表明模型方程极显著，不同处理间的差异极显著；失拟项P=0.175 7＞0.05，差异不显著；模型的校正决定系数R2Adj=0.938 5，说明该模型能解释约93.85%响应值的变化，表明方程拟合程度良好，实验误差小，可以用来分析和预测芸豆清蛋白的提取率。四个一次项F值大小依次为X1＞X2＞X3＞X4，说明提取温度对芸豆清蛋白的提取率影响最大，提取时间和液料比次之，粉碎粒度对芸豆清蛋白提取率的影响最小。

利用响应面法优化技术参数，可以在单因素的基础上，有效的通过软件拟合，找出最佳的技术参数，从而得到最优结果。

3.5.2 单因素效应分析

采用降维方法，将其他四因子固定在0编码水平，分别描述单个因素变动对芸豆清蛋白提取率的影响。

提取温度（X1），提取时间（X2），液料比（X3），粉碎粒度（X4）的单因素效应方程为：

根据此方程，分别得到提取温度（X1）、提取时间（X2）、液料比（X3）、粉碎粒度（X4）的单因子效应曲线如图5所示。

图5 芸豆清蛋白提取率分析值单因子效应曲线Fig.5 Single factor curve of analysis value on albumin extraction yield of kidney bean

由图5可以看出，在实验范围内芸豆清蛋白提取率值随着四个因素的变化呈现先增加后降低的趋势。

将单因子方程对其本身求一阶偏导数，得到单因子的边际效应方程。单因子的边际效应反映Y值随各因子投入水平而变化的速率。

提取温度（X1）、提取时间（X2）、液料比（X3）、粉碎粒度（X4）的单因子边际效应方程为：

图6 芸豆清蛋白提取率分析值单因子边际效应曲线Fig.6 Single factor marginal curve of analysis value on albumin extraction yield of kidney bean

从图6可以看出，提取温度（X1）在编码0.45之前对芸豆清蛋白提取率的影响为正效应，0.45编码之后对芸豆清蛋白提取率的影响负效应；提取时间（X2）在0.48之前对芸豆清蛋白提取率的影响为正效应，0.48编码之后对芸豆清蛋白提取率的影响为负效应；液料比（X3）在0.34之前对芸豆清蛋白提取率的影响为正效应，0.34编码之后对芸豆清蛋白提取率的影响为负效应；粉碎粒度（X4）在0.22之前对芸豆清蛋白提取率的影响为正效应，0.22编码之后对芸豆清蛋白提取率的影响为负效应，以提取温度影响最大，提取时间和液料比的影响次之，粉碎粒度的影响最小。

3.5.3 双因素效应分析

为了得到某两个因素同时对清蛋白提取率的影响，采用降维分析方法，观察在其他因素条件固定不变情况下，某两个因素对清蛋白提取率的影响，即提取温度（X1）与粉碎粒度（X4）交互作用及提取温度（X1）与提取时间（X2）交互作用对清蛋白提取率的影响显著。图7和图8是根据多元回归方程作出的等高线图及响应曲面，对这些因素中交互项之间的交互效应进行分析。

图7 Y=f（X1，X4）的响应面图等高线图及其响应曲面图Fig.7 Responsive contour plot and surfaces of Y=f（X1，X4）

由X1与X4的交互图可以看出，当提取温度（X1）与粉碎粒度（X4）处于高编码值时，二者交互作用显著，Y值处于较高水平；随着提取温度（X1）与粉碎粒度（X4）编码值的增加，响应值逐渐增大；但当响应值增大到某极值后，随着自变量的增大响应值有减小的趋势。

图8 Y=f（X1，X2）的响应面图等高线图及其响应曲面图Fig.8 Responsive contour plot and surfaces of Y=f（X1，X2）

由提取温度（X1）与提取时间（X2）的交互图可以看出，当提取温度（X1）与提取时间（X2）处于高编码值时，二者交互作用显著，Y值处于较高水平；随着提取温度（X1）与提取时间（X2）编码值的增加，响应值逐渐增大；但当响应值增大到某极值后，随着自变量的增大响应值有减小的趋势。

由图7和图8可以看出，等高线均呈椭圆，表示提取温度（X1）与粉碎粒度（X4）及提取温度（X1）与提取时间（X2）之间的交互作用对芸豆清蛋白提取率都有一定的影响，响应曲面图均开口向下、凹面，表明响应值的大小随着自变量的大小而改变，而且增减幅度也不一样。随着各个自变量的增大，响应值逐渐增大，但当响应值增大到某极值后，随着自变量的增大，响应值有减小的趋势。由图可知该模型的试验范围内存在稳定点，且稳定点是最大值。

3.5.4 响应面优化结果与技术参数验证

通过Design-Expert.V8.0软件优化得出小分子团磁化水提取芸豆清蛋白提取率的最佳工艺参数为：提取温度31℃、提取时间2 h、液料比22∶1、粉碎粒度60目，并得出最大清蛋白提取率49.21%。对该技术参数结果进行3次验证实验，结果得出小分子团磁化水提取芸豆清蛋白提取率为48.96%，实验值与模型的理论值非常接近，且重复实验相对偏差不超过1%，说明重现性良好，故该模型合理，优化结果可行。

图9 芸豆清蛋白SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.9 SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis of kidney bean albumin

图10 芸豆清蛋白SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量对数与相对迁移率曲线图Fig.10 Molecular weight and relative mobility logarithmic on SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis graph of kidney bean albumin

3.6 芸豆清蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分析

图9是对试验中提取的芸豆清蛋白进行的SDS-PAGE凝胶电泳表征。该电泳图上有5条明显谱带，将蛋白Marker分子量的对数与相对迁移率作标准曲线（图10），求得分子量对数与相对迁移率关系式为：y=-1.208 8x+5.366 4，R2=0.995 3

R2为0.995 3，说明分子量对数与相对迁移率的相关性强。将芸豆清蛋白条带相对迁移率带入公式，得到清蛋白分子量对数，进而求得芸豆清蛋白分子量。图中分别呈现1、3 mg·mL-1和5 mg·mL-1三个不同浓度的清蛋白电泳图谱，可看出，在不同浓度添加量下，芸豆清蛋白主要在42.01 kDa分子量聚集，该亚基分子组成居多。贾俊强在2009年研究了脱脂小麦胚芽蛋白分类及其氨基酸组成分析，利用SDSPAGE凝胶电泳测得小麦胚芽清蛋白亚基分子量范围主要在38.2～52.48 kDa[11-12]；崔竹梅在2007年研究了鹰嘴豆籽粒清蛋白和球蛋白等电点、相对分子量的测定，利用SDS-PAGE凝胶电泳测得鹰嘴豆清蛋白亚基相对分子量范围为35～62 kDa[13]；李永武在2014年研究了绿豆清蛋白的提取及其功能特性和理化性质研究，利用SDS-PAGE凝胶电泳测得绿豆清蛋白亚基蛋白分子量多数在48.99 kDa范围内[14]。前人的研究结果说明清蛋白的分子量基本在30～60 kDa范围内，而本实验通过SDS-PAGE凝胶电泳分析所得到的芸豆清蛋白分子量为42.01 kDa，与前人测得的清蛋白分子量相符，说明实验所得蛋白产品是清蛋白。

4 结论

通过对小分子团磁化水、自来水和纯净水作提取芸豆清蛋白的试验，得出在不同提取温度、不同提取时间、不同液料比和不同粉碎粒度四个因素下的最佳提取效果，当提取温度30℃，提取时间2 h，液料比20∶1，粉碎粒度60目时芸豆清蛋白的提取率均最高，其中小分子团磁化水组提取率为48.87%，高于自来水组（42.79%）和纯净水组（40.87%）；通过对小分子团磁化水提取的芸豆清蛋白进行SDS-PAGE电泳测试，发现其分子量排布主要集中在42.01 kDa左右，这与贾俊强、崔竹梅、李永武等人测定的清蛋白分子量相符，说明所提取的蛋白为清蛋白。

实验中通过Design-Expert.V8.0软件中心组合试验设计，对小分子团磁化水提取芸豆清蛋白的工艺关键参数进行了优化，最终确定提取温度31℃、提取时间2 h、液料比22∶1，粉碎粒度60目。其理论值为49.21%，验证试验后，清蛋白提取率达到了48.96%。实验证明，利用小分子团磁化水提取芸豆清蛋白有效的提高了清蛋白的提取率。

［1］ 柴岩，冯佰利，孙世贤.中国小杂粮品种［M］.北京：中国农业科学技术出版社，2007.

［2］ TömösköziS，GyengeL，PelcéderÁ，etal.Functional Properties of Protein Preparations from Amaranth Seeds in Model System ［J］.Eur.Food Res.Technol.，2008，226：1343-1348.

［3］ 马文鹏，任海伟.芸豆蛋白的提取及其营养价值评价［J］.食品科技，2013，38（1）：75-79.

［4］ 刘高梅，任海伟.不同功率超声波对芸豆蛋白理化和功能性质的影响［J］.中国粮油学报，2012，27（12）：17-21.

［5］ 崔旭海，孔宝华.羟基自由基氧化对乳清蛋白氨基酸含量的影响［J］.食品工业科技，2010，31（10）：85-89.

［6］ 丁振瑞，赵亚军，陈凤玲，等.磁化水的磁化机理研究［J］.物理学报，2011，60（6）：432-439.

［7］ 连玉新，张东杰，王颖.响应面法优化酶改性大豆分离蛋白条件的研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（2）：65-70.

［8］ 程皓，于长青，王长远.酶解米糠蛋白功能性质的研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2014，26（5）：53-58.

［9］ 张敏，李青山，秦凯.小分子团水对化合物溶解性影响的微型实验设计［J］.内蒙古民族大学学报，2009，15（4）：109-110.

［10］ 叶红艳，刘瑞瑛，皮江，等.小分子团水与普通蒸馏水的红细胞渗透速率比较［J］.科技创新导报，2011（9）：6-7.

［11］ 贾俊强，马海乐，骆琳，等.脱脂小麦胚芽蛋白分类及其氨基酸组成分析［J］.中国粮油学报，2009，24（2）：40-43.

［12］ 贾俊强，马海乐，赵伟睿，等.超声波处理对小麦胚芽球蛋白理化和功能性质的影响［J］.过程工程学报，2009，9（1）：107-112.

［13］ 崔竹梅，王红玲，张占琴，等.鹰嘴豆籽粒清蛋白和球蛋白等电点、相对分子量的测定［J］.干旱地区农业研究，2007，25（6）：89-95.

［14］ 李永武，张丽萍.绿豆清蛋白的提取及其功能特性和理化性质研究［D］.大庆：黑龙江八一农垦大学，2014.