张建军，薛科邦，何茂昌，徐建峰，赵生国，白雅琴，王耀荣，谢文章

（1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃，平凉744000；2.甘肃农业大学动物科学技术学院；

3.华池县畜牧兽医站；4.环县畜禽改良站）

生长激素（growth hormone，GH）是由动物垂体前叶分泌的一种蛋白类激素，它具有广泛的生理功能，能影响蛋白质、脂肪、糖类三大物质的代谢。GH 基因存在单核苷酸多态性，与动物的体重、产奶量、产绒量等部分经济性状具有一定关联性，可以作为影响生长发育性状的重要候选基因进行分子标记辅助选择。陇东绒山羊是经30年培育的地方优良品种，具有体质结实、体型外貌一致、遗传性稳定、耐粗饲、抗病力强等优点，已成为陇东地区养殖的主导山羊群体。为了充分保护和开发利用陇东绒山羊优良的遗传资源，本研究采用PCR－SSCP 方法，以陇东绒山羊为研究对象，对GH 基因第一外显子和第四外显子进行多态性分析，研究陇东绒山羊生长激素（growth hormone，GH）基因遗传多态性，旨在寻找与生产性能相关的SNPs位点，为后期开展分子标记辅助选择，加快新品种选育进展提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 从华池县悦乐绒山羊繁育中心、环县惠农绒山羊发育基地随机选择陇东绒山羊160只，作为试验动物。从羊颈静脉采血，加入ACD 抗凝剂后带回实验室，－20 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 Taq DNA 聚合酶、蛋白酶K、dNTP购自宝生物工程（大连）有限公司；pGEM－T载体及T4DNA Ligase购自Promega公司；质粒提取试剂盒（TIANprep Mini）和凝胶回收试剂盒（TIAN－gel Mini）购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血液基因组DNA 的提取 参照酚－氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA，－20 ℃保存，然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

1.2.2 引物设计及PCR 扩增 参照GenBank登陆的山羊序列（D00476），利用Primer Premier 5 软件分别在GH 基因第1外显子（Exon1）和第4外显子（Exon4）处各设计一对引物，由宝生物工程（大连）有限公司合成。引物序列、扩增区域及PCR 产物的大小见表1。

表1 引物序列、PCR 产物的大小及扩增区域

PCR 扩增反应体系为25μL，包括：10×PCR buffer（15 mmol Mg2＋）2.5 μL；dNTPs（各2.5 mmol）1.6μL；引物混合物（10μm）2.0μL；Taq DNA 聚合酶（5 U／μL）0.2μL；DNA 模板（50ng／μL）1.0μL；其余用超纯水补齐至25μL。2 对引物的PCR 扩增 条 件：95 ℃预 变 性5 min；94 ℃变 性45s，X℃（引物GH－1、GH－2的退火温度依次为55 ℃、58 ℃）退火45sec，72 ℃延伸1min，共35个循环；最后72 ℃延伸8min；4 ℃保存。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，GoldView （GV）染色检测结果。

1.2.3 SSCP分析 取2μL PCR 产物与8μL 变性缓冲液（98%甲酰胺、10mmol／L EDTA、0.025%溴酚兰、0.025% 二甲苯青），98℃变性10 min，置于冰水浴中5min，上样于浓度为8%、交联度为39∶1（引物Exon4）和浓度为14%、交联度为49∶1（引物Exon1）的非变性聚丙烯酰胺凝胶中；在4℃、250v的条件下预电泳20min，然后恒温恒压过夜；电泳结束后用银染法染色显影，直至出现清晰的条带，用紫外成像仪观察成像。

1.2.4 克隆测序 经SSCP 分析后，将不同基因型纯合型个体的PCR 产物用柱式胶回收试剂盒回收纯化，用PGM－T 载体连接，JM109 菌株转化，提取重组质粒作为测序模板送至上海桑尼生物公司进行测序，应用BioEdit生物软件进行序列分析。

2 试验结果

2.1 PCR－SSCP检测结果

引物Exon1和Exon4扩增后到与理论大小一致的特异条带（见图1和图2），且无任何非特异性条带，可直接进行后续SSCP检测分析。

图1 Exon1 位点2%琼脂糖检测结果

图2 Exon4 位点2%琼脂糖检测结果

从图3可以看出，Exon1位点不存在SSCP 多态性，均为野生型。从图4可以看出，Exon2位点存在SSCP多态性，产生G、H 两个等位基因，具有3种基因型，依次命名为GG、HH、GH。

图3 Exon1 位点PCR－SSCP结果

图4 Exon4 位点PCR－SSCP结果

2.2 序列分析

以序列D00476为参照，利用BioEdit软件进行序列比对，结果表明，Exon4位点，HH 型与GG型相比，在D00476序列1450bp处发生了C→T 的单碱基突变（见图5、图6）。Exon1位点，HH 型与GG 型碱基序列一致，未出现碱基突变、缺失、插入等。

图5 Exon4位点GG 基因型核苷酸序列

图6 Exon4位点HH 基因型核苷酸序

2.3 基因型频率和等位基因频率

从2可以看出，Exon4位点，陇东绒山羊群体中以等位基因G 为主，基因频率为0.575；基因型频率以GG 最高，HH 次之，GH 最低。

表2 Exon4位点基因频率和基因型频率分析

3 讨论

陇东绒山羊作为优良地方品种，选育历史悠久，于1984年被列入《甘肃省畜禽品种志》。近年来，陇东地区将养殖陇东绒山羊作为一项富民产业来抓，致力于纯种保护和羊绒等产品开发，取得了一定成绩。但品种选育工作仅仅局限于传统育种层面，还未利用分子生物学手段对影响陇东绒山羊重要经济性状的的功能基因及多态位点进行深入研究，影响了优质高效绒山羊新品种（品系）的选育进程。本研究首次采用PCR－SSCP方法对陇东绒山羊的GH基因多态性进行分析，发现在Exon4位点1450bp处发生了C→T 的单碱基突变，这可能与陇东绒山羊在长期选育过程中引入内蒙绒山羊、辽宁绒山羊等外来品种进行级进杂交，造成群体遗传结构变化有关。胡沈荣等在关中奶山羊、陕南白山羊等山羊品种GH 基因外显子Ⅴ、5′调控区也检测到SNPS位点，这与本试验结果类似。此外，Exon4位点突变产生了GG、HH、GH 三种基因型，且基因型以GG型为主这与向德、闵令江等报道的研究结果有相似之处，但白文林、李中原等研究发现，在山羊GH 基因仅检测到两种基因型，这可能与由于样本含量、检测位点、选育环境等不同有关，尚有待于进一步研究。

寻找影响家畜生产性能的遗传标记是当前家畜遗传育种的主要目的，而候选基因法则是实现这一目的的重要手段。本研究进一步验证了GH 基因在陇东绒山羊上存在遗传多态性，今后，应寻找更多影响陇东绒山羊生产性能的相关候选基因及多态性位点，并在此基础上开展生产性能相关性分析，以便更好地为陇东绒山羊遗传资源的保护和开发利用提供理论依据。

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