张洪亮++范华东++陆华东

[摘要] 目的 分析大容量双肺灌洗（Massive whole-lung lavage，MWLL）对煤尘肺患者免疫细胞及细胞因子的影响，为煤尘肺患者的治疗提供依据。 方法 对70例煤尘肺患者实施MWLL治疗，共灌洗10～15次，治疗前、治疗后采用酶联免疫吸附法检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、Clara细胞分泌蛋白-10（CC-10）、转化因子-β1（TGF-β1），采用流式细胞仪检测外周血T细胞亚群。 结果 治疗后Ⅰ期、Ⅱ期患者CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、TNF-α、TGF-β1、CC-10与治疗前比较，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；Ⅲ期患者治疗后CD4+、CD4+/CD8+比值、TNF-α、TGF-β1与治疗前比较，差异有统计学意义（P<0.05），但治疗前、后CD8+、CC-10比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 MWLL治疗在短期内能改善煤尘肺患者的体液免疫及细胞免疫。

[关键词] 煤尘肺；大容量双肺灌洗；T细胞亚群；细胞因子

[中图分类号] R472 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）01-0013-03

Massive whole-lung lavage impact on immune cells and cytokines in patients with pneumoconiosis

ZHANG Hongliang1 FAN Huadong1 LU Huadong2

1.Changguang Group Iimited Iiability Company Worker's Hospital，Huzhou 313117， China；2.Respiratory Department， Huzhou City Centre Hospital in Zhejiang Province，Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To analyze MWLL impact on immune cells and cytokines in patients with pneumoconiosis，and to provide the basis for coal pneumoconiosis patients. Methods 70 cases of pneumoconiosis implement MWLL treatment of lavage 10 to 15 times，by enzyme-linked immunosorbent assay of serum tumor necrosis factor-α（TNF-α），Clara cell secretory protein 10（CC-10），transforming growth factor-β1（TGF-β1），the use of flow cytometry in peripheral blood T cell subsets before and after treatment. Results CD4+，CD8+，CD4+/CD8+ratio，TNF-α，TGF-β1，CC-10 of periodⅠ，Ⅱpatients，the difference was statistically significant after treatment compared with before treatment （P<0.05 or P<0.01）； CD4+，CD4+/CD8+ratio，TNF-α，TGF-β1 of period Ⅲ patients，the difference was statistically significant after treatment compared with before treatment（P<0.05，but the difference of CD8+，CC-10 was not statistically significant（P>0.05）. Conclusion MWLL treatment can improve coal pneumoconiosis humoral and cellular immunity in the short term.

[Key words] Coal pneumoconiosis； Lavage lung capacity； T cell subsets； Cytokine

煤尘肺多因患者长期暴露在高粉尘环境中，煤尘堆积在肺内所致[1]。然而，临床对于煤尘肺的具体发病机制目前尚无定论，可能与煤尘堆积引发的细胞免疫紊乱及炎性反应有关[2]。大容量双肺灌洗（MWLL）最早是用于治疗肺泡蛋白沉着症，其通过清除沉着的蛋白而改善患者体液免疫及细胞免疫功能，进而达到治疗的目的。本文对70例煤尘肺患者实施MWLL治疗，分析其对患者T免疫细胞亚群及与煤尘肺相关的细胞因子的变化，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年1月～2014年1月到长广医院就治的煤尘肺患者70例。入选标准：①符合《尘肺病诊断标准》（GBZ70-2009）中相关诊断标准[3]，并经高仟伏X射线胸片检查确诊；②符合MWLL治疗指征；③接触煤尘、岩尘、混合粉尘的混合性或单纯尘肺患者。排除标准：①年龄>65岁；②心肺功能低下、凝血功能障碍、伴有严重支气管畸形者；③伴有活动性肺结核者；④近2周有肺部感染、哮喘表现。70例均为男性，其中Ⅰ期28例，年龄35～59岁，平均（51.3±8.2）岁；接触粉尘年限10～32年，平均（22.1±7.7）年；Ⅱ期32例，年龄32～60岁，平均（50.7±8.1）岁；接触粉尘年限8～33年，平均（22.5±7.5）年；Ⅲ期10例，年龄30～57岁，平均（51.2±8.3）岁；接触粉尘年限7～34年，平均（22.6±7.8）年。三组一般资料比较无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 MWLL方法

70例均在静脉复合麻醉下实施MWLL治疗。患者取平卧位或取灌洗侧居上斜卧位（25°～30°），连接Solar多功能监护仪，将双腔支气管导管（RoberFshaw 管）插入患者支气管及气管，确认双肺隔离满意后，一侧肺给予纯氧通气，另一侧采用细支气管镜检查确定球囊定位良好后开始灌洗，一般先右后左。在灌洗前将灌洗液加温至37℃，首次灌洗500 mL，观察患者心电图、血氧饱和度等无异常则反复灌洗。根据肺容量每次灌入量1000～2000 mL，随后负压4～5 kPa吸出等量的肺灌洗液，于第3、6、9次负压吸出灌洗液末给予加压纯氧通气，加压最大压力<4 kPa，负压吸出与正压通气要交替进行，反复灌洗[4]。一侧灌洗结束后，待残留液基本吸收，患者呼吸基本恢复、肺顺应性接近灌洗前水平，生命体征平稳后，以相同方法换另一侧灌洗，双肺共灌洗10～15次，直至灌洗回收液变清亮为止，一般一侧灌洗次数<12次。

1.3 检测方法

治疗前2 d及MWLL灌洗结束后2 d分别抽取空腹静脉血4 mL。取2 mL静脉血置于EDFA抗凝管中，采用Beckman流式细胞仪（美国生产）检测F淋巴细胞亚群CD4+、CD8+占细胞总数的比例，并计算两者的比值。试剂购于美国BD公司，采用CD4+FITC、CD8+PE鼠抗人荧光标记抗体。再取2 mL进行3000 r/min离心处理10 min，取上层血清，置于-20℃冰箱中保存。12 h内采用双抗酶联免疫吸附法检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、Clara细胞分泌蛋白-10（CC-10）、转化因子-β1（TGF-β1）。仪器为ELX800酶标仪（美国生产），试剂盒购于深圳晶美生物工程有效公司。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计学分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用F检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前、后免疫细胞变化

Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治疗后CD4+、CD4+/CD8+比值高于治疗前，Ⅰ期、Ⅱ期患者治疗后CD8+低于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05）；Ⅲ期患者CD8+治疗前、后比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 治疗前、后细胞因子变化

Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治疗后TNF-α高于治疗前，TGF-β1显著低于治疗前；Ⅰ期、Ⅱ期患者治疗后CC-10高于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05），但Ⅲ期患者CC-10治疗前、后比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

3 讨论

我国是煤尘肺的高发地区，据统计我国煤尘肺患者约有100万人，占全世界的50%以上，而且每年新增600例以上[5]，对患者生活质量及生存带来巨大威胁。

煤尘沉积引发煤尘肺的机制复杂，但其病因明确。粉尘滞留在毛细支气管及肺泡上引发炎症反应及吞尘使巨噬细胞增加是煤尘肺的主要致病因素[6]。Toru等[7]研究发现，在煤尘肺进展过程中，有大量的活性介质及细胞因子参与，同时伴有免疫功能失衡。Rong等[8]研究报道，在煤尘肺进展过程中，各种炎性介质及细胞因子表现出不同的变化，最典型的是TNF-α下降、TGF-β1升高、白细胞介素-6（IL-6）升高。同时T细胞亚群在数量及比例上也有所改变，如CD4+下降，CD8+升高，CD4+/CD8+下降等。本研究中煤尘肺患者治疗前均伴有TNF-α下降，FGF-β1升高，CD4+下降， CD8+升高，CD4+/CD8+下降等表现，尤其是Ⅲ期患者上述细胞因子及免疫细胞变化更明显，与文献报道基本相符，证实在煤尘肺进展中伴有免疫功能及细胞因子失调。

MWLL最早是用于治疗肺泡蛋白沉着症[9]，由于其能有效清除残留在肺泡内的粉尘、炎性细胞及巨噬细胞等而在煤尘肺的治疗中广泛适用，但其治疗机制目前尚未明确，临床推测其可能通过改善机体免疫功能及纠正细胞因子紊乱而实现治疗目的[10]。煤尘肺患者肺泡内大量沉积的难溶性煤尘对巨噬细胞有毒性作用，导致肺泡内巨噬细胞凋亡，使得TNF-α合成及释放减少，严重影响机体免疫功能。Steffen等[11]研究报道，MWLL可将沉积在肺泡内的沉渣、粉尘清除，机体内环境得到改善，TNF-α的释放增加。我国学者蔚岩等[12]研究得到相同的结论，机体吸入大量的粉尘后，粉尘直接损伤Clara细胞、巨噬细胞，使得CC-10蛋白、TNF-α的合成及释放减少，随着机体粉尘的清除，CC-10、TNF-α的含量逐渐上升。本研究中Ⅰ期、Ⅱ期患者治疗后CC-10、TNF-α均有明显上升，提示MWLL可纠正机体细胞因子紊乱。TGF-β1是肺部纤维化发展的重要调节因子，其通过上调纤维粘连蛋白与胶原蛋白基因的表达而降低蛋白酶的分泌，从而参与尘肺的纤维化进程[13]。本研究中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治疗前TGF-β1显著升高，尤其是Ⅲ期患者的TGF-β1含量是普通人的3倍。张志平等[14]研究认为，煤尘肺患者TGF-β1含量升高的原因是粉尘中含有大量的SiO2，SiO2可激活网状内皮系统物质，其中包括TGF-β1，进而促进胶原纤维纤维化进程。本研究中，治疗后Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者TGF-β1显著低于治疗前（P<0.05），可能与MWLL将沉积在肺内的SiO2清除有关。

国内外研究均证实，煤尘堆积在肺泡内损伤巨噬细胞，一方面可促进炎性细胞的释放而产生炎症反应；另一方面可释放一种强烈的内源性免疫抑制剂前列腺素 E2（PEG2），使T细胞免疫功能瘫痪[15]。本研究中Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治疗前CD4+下降，CD8+升高，CD4+/CD8+下降，免疫功能受到一定抑制。MWLL治疗后，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者治疗后CD4+、CD4+/CD8+比值高于治疗前，Ⅰ期、Ⅱ期患者治疗后CD8+低于治疗前（P<0.05），与Ga■Fane等[16]报道基本相符，证实MWLL可改善煤尘肺患者的细胞免疫功能。

值得注意的是，由于晚期煤尘肺（Ⅲ期）患者肺纤维化程度严重，临床认为晚期煤尘肺患者洗肺治疗的收效甚微，往往放弃洗肺治疗。本研究中，Ⅲ期患者经过MWLL治疗后，T细胞亚群、细胞因子的变化虽然没有Ⅰ期、Ⅱ期患者的明显，或所需的疗程较长，但治疗后TNF-α、TGF-β1、CD4+、CD4+/CD8+比值与治疗前比较有显著差异（P<0.05），提示对Ⅲ期煤尘肺患者进行全肺灌洗的重要性。

综上所述，MWLL治疗在短期内能改善煤尘肺患者的体液免疫及细胞免疫。

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（收稿日期：2014-06-05）