陈宏武，王曙东，3

(1.盐城工业职业技术学院纺织服装学院，江苏 盐城 224005;2.盐城工业职业技术学院生态纺织研发工程中心，江苏 盐城 224005;3.苏州大学纺织与服装学院，江苏 苏州 215123)

蚕丝的使用有上千年的历史，因其产量丰富，有良好的力学性能、珍珠般的光泽、柔和的手感，享有纤维皇后的美誉［1－3］。蚕丝纤维主要由30%的丝胶蛋白和70%的丝素蛋白构成，作为蚕丝纤维最主要的成分，丝素蛋白(又称蚕丝蛋白)因其优异的生物相容性和生物可降解性，良好的透气透湿性，无毒、无刺激性和良好的力学性能［4－5］，已成为当前的研究热点。目前国内外已有大量关于丝蛋白支架材料的研究报道，如蚕丝蛋白凝胶［6］、蚕丝蛋白纳米纤维［7］、蚕 丝 蛋白海绵支架［8］、蚕丝蛋白微球［9］、蚕丝蛋白粉末［10］、蚕丝蛋白膜［11］和蚕丝蛋白管［12］等，被广泛应用于组织工程支架材料［13］、药物缓释材料［14］、光子晶体材料［15］、电子器件［16］等领域。蚕丝蛋白水凝胶因其制备技术简单成熟，与细胞的亲和性好，植入机体内不会产生免疫排斥反应，可生物降解易吸收等优点，引起了国内外学者极大的兴趣，并被广泛应用于各种机体组织的修复。

本文从蚕丝蛋白水凝胶的制备方法、蚕丝蛋白基水凝胶及其力学性能、凝胶成型机制、蚕丝蛋白水凝胶的快速成型等方面结合本课题组对蚕丝蛋白水凝胶的相关研究对蚕丝蛋白水凝胶的研究进展进行了综述。

1 蚕丝蛋白水凝胶的制备方法

蚕丝蛋白水凝胶是由蚕丝蛋白水溶液通过不同的凝胶方法制备而成。而蚕丝蛋白水溶液的制备已非常成熟并不断优化，即蚕茧(或蚕丝)经碳酸钠(或碳酸氢钠)脱胶去除丝胶后经溶解体系溶解，用去离子水透析可制得蚕丝蛋白水溶液。常用的溶解体系为三元溶剂(乙醇-碳酸钙-水)和溴化锂水溶液。图1示出采用溴化锂溶解体系制备的蚕丝蛋白水溶液［17］。蚕丝蛋白水溶液经旋流剪切、超声振荡、酸(离子液体或表面活性剂)处理、浓缩(或自然凝胶)、通过电流等可制备蚕丝蛋白水凝胶。

图1 蚕丝蛋白水溶液的制备Fig.1 Preparation of silk fibroin solution and hydrogels

1.1 旋流剪切凝胶

旋流剪切凝胶方法较为简单，即采用涡旋振荡器对丝蛋白溶液进行高速的旋流剪切振荡(如图2所示)，振荡后凝胶成为蚕丝蛋白水凝胶。Yucel等［18］采用旋流剪切凝胶的方法制备了蚕丝蛋白水凝胶，涡旋振荡器的旋流剪切频率为3200 r/min，研究了旋流剪切时间对蚕丝蛋白水凝胶的二级结构以及凝胶黏弹性的影响。Rockwood等［17］认为将蚕丝蛋白水溶液与细胞复合，可制备蚕丝蛋白细胞复合凝胶体系。

图2 旋流剪切制备蚕丝蛋白凝胶Fig.2 Preparation of vortexed silk fibroin gels

1.2 超声凝胶

超声凝胶方法即采用超声波振荡器对蚕丝蛋白水溶液进行处理。Wang等［19］采用功率为450W的超声振荡器对蚕丝蛋白水溶液进行振荡处理，获得蚕丝蛋白水凝胶，并研究了超声振荡的凝胶机制以及蚕丝蛋白水凝胶的细胞亲和性。Hu等［20］采用超声振荡法制备蚕丝蛋白/透明质酸复合水凝胶，并研究了复合凝胶的二级结构和生物相容性。

1.3 酸凝胶

酸凝胶是将一些弱酸、离子液体、表面活性剂等化学试剂加入到蚕丝蛋白水溶液中以改变蚕丝蛋白的二级结构，从而使蚕丝蛋白水溶液凝胶。Yucel等［21］向质量分数为7.3%的蚕丝蛋白水溶液中滴入稀释的盐酸溶液以调整蚕丝蛋白水溶液的pH值，达到制备蚕丝蛋白水凝胶的目的，研究了pH值对蚕丝蛋白水凝胶黏弹性的影响和酸凝胶机制，比较了几种常见凝胶方法对蚕丝蛋白二级结构的影响。Silva等［22］采用向蚕丝蛋白基水溶液滴加离子液体的方法，制备了壳聚糖/蚕丝蛋白复合水凝胶，研究了离子液体加入量对复合凝胶体系二级结构和黏弹性的影响。Wu等［23］向蚕丝蛋白水溶液中加入十二烷基硫酸钠，使得蚕丝蛋白快速凝胶，并着重研究了该方法的凝胶机制。

1.4 浓缩凝胶和自然凝胶

浓缩凝胶是将一定质量分数(通常为3% ～8%)的蚕丝蛋白水溶液置于再生纤维素透析袋中，然后将该透析袋置于聚乙二醇的水溶液中，使得聚乙二醇溶液从蚕丝蛋白水溶液中不断进行吸水，蚕丝蛋白水溶液不断浓缩以达到凝胶的目的，凝胶时间通常要1～2 d。自然凝胶是将蚕丝蛋白水溶液置于流通的空气中或置于冰箱保鲜层中一段时间后自行凝胶的现象，但是自然凝胶通常需要1个月以上的时间。这种方法存在凝胶周期长、凝胶质量较差的问题，作为生物医用材料的蚕丝蛋白水凝胶不宜采用该种方法。

1.5 电凝胶

电凝胶是将直流电源(通常为15～30 V)的正负极通入蚕丝蛋白水凝胶中，蚕丝蛋白水凝胶会逐渐集聚到直流电源的正极。图3示出采用30 V的直流电源通入蚕丝蛋白水溶液中的集聚现象。由图可见，在直流电源的正极(石墨板)逐渐集聚一层蚕丝蛋白水凝胶，且随着时间的延长，蚕丝蛋白水凝胶逐渐增大。

图3 蚕丝蛋白电凝胶Fig.3 Preparation of silk fibroin electrogels

Leisk等［24］研究表明采用电凝胶制备蚕丝蛋白水凝胶是一个可逆的过程(如图4所示)，即当交换通入电源的正负极时，原集聚在电源正极的蚕丝蛋白水凝胶逐渐消失，但又不断地积聚到新的电源正极(原负极)上。

图4 蚕丝蛋白电凝胶的可逆现象Fig.4 Reversible phenomenon in process of silk fibroin electrogel

综上所述，制备蚕丝蛋白水凝胶的方法多种多样，旋流剪切凝胶和超声凝胶会在一定程度上破坏蚕丝蛋白大分子结构;酸、离子液体、表面活性剂的加入也会在一定程度上影响蚕丝蛋白水凝胶的生物相容性;浓缩凝胶的时间较长;电凝胶方法简单、效率较高，不破坏蚕丝蛋白大分子结构、不影响蚕丝蛋白生物相容性，且存在可逆现象，因此本文认为电凝胶是制备蚕丝蛋白水凝胶的理想方法。

2 蚕丝蛋白水凝胶形成机制

Kim等［25］研究表明蚕丝蛋白水凝胶的形成机制是由于蚕丝蛋白大分子链相互之间存在作用力，这些作用力主要包含疏水基团之间的相互作用力和氢键等相互作用力。当受到外界因素(电场、超声、酸等)作用时，蚕丝蛋白分子链之间更易形成相互作用力，导致蚕丝蛋白大分子链之间形成物理交联，生成蚕丝蛋白凝胶。Lu等［26］研究了蚕丝蛋白水凝胶的电凝胶机制，研究结果表明正常状态下蚕丝蛋白水溶液中蚕丝蛋白无规卷曲部分的负电荷在蚕丝蛋白大分子链中占据主导地位，溶液的pH值大于蛋白质的等电点(pI)，分子间相互排斥阻止了分子间相互作用形成β折叠结构(如图5所示)。此时蚕丝蛋白呈溶液状态。当给蚕丝蛋白水溶液施加电场后，蚕丝蛋白水溶液中的电源正极附近的质子浓度逐渐增加，导致该区域的pH值小于蛋白质的等电点，蚕丝蛋白大分子链之间相互作用形成β折叠结构，并逐渐交联形成蚕丝蛋白胶束(微球)。蚕丝蛋白胶束(微球)的形貌如图6所示。

图5 蚕丝蛋白水凝胶形成机制示意图Fig.5 Mechanism of electrogels of silk fibroin

图6 蚕丝蛋白胶束(微球)的形貌结构Fig.6 Morphology of silk fibroin micelle.(a)SEM image of silk fibroin micelle;(b)AFM image of silk fibroin micelle

蚕丝蛋白胶束的数量不断增加，逐渐形成了蚕丝蛋白水凝胶。Wang等［19］研究了蚕丝蛋白水凝胶超声凝胶机制，如图7所示。研究结果表明由于超声波振荡导致蚕丝蛋白大分子链中的β折叠结构(疏水基团之间的相互作用)逐渐增加并相互交联逐渐形成蚕丝蛋白水凝胶。

图7 蚕丝蛋白水凝胶的超声凝胶机制Fig.7 Mechanism of ultrasonic-induced silk fibroin gel

综上所述，无论是哪种方法制备的蚕丝蛋白水凝胶，其主要机制均是通过蚕丝蛋白大分子之间相互作用形成β折叠结构，导致蚕丝大分子链之间相互纠缠、集聚，形成蚕丝蛋白微球胶束，随着为微球胶束的集聚逐渐形成凝胶。

3 蚕丝蛋白复合水凝胶

蚕丝蛋白具有优异的生物相容性和生物可降解性，但也存在材料力学性能差，凝胶质量低，效率低，对骨支架修复存在缺陷，抗菌性能差，吸水(保水)性差(亲水性差)等缺陷，为改善这些缺陷，研究人员常采用一些功能性纳米材料或功能性高聚物材料对蚕丝蛋白水凝胶进行改性(如表1所示)。

Huang等［27］将氧化石墨烯共混加入蚕丝蛋白中制备了蚕丝蛋白/氧化石墨烯复合凝胶体系，研究结果表明氧化石墨烯的共混极大地增加了蚕丝蛋白水凝胶的力学强度，控制适当的氧化石墨烯共混比例可以使复合凝胶体系的断裂强度增加至纯丝蛋白凝胶的5倍。Huang等［28］采用旋流剪切法制备了蚕丝蛋白/聚氨酯复合水凝胶，研究结果表明聚氨酯与蚕丝蛋白具有良好的相容性，且聚氨酯的共混改善了蚕丝蛋白硬脆的特性，复合凝胶体系的柔性有了较大的改善。

Gong等［29］采用超声法制备了蚕丝蛋白/羟基纤维素复合凝胶体系，羟基纤维素的混入改善了凝胶质量，缩短了凝胶时间。Kojic等［30］在蚕丝蛋白水凝胶中掺杂金纳米粒子，研究结果表明掺杂了金纳米粒子的蚕丝蛋白水凝胶具有优异的抗菌性能，用于组织修复时可避免细菌感染。Kim等［31］和Ming等［32］将羟基磷灰石与蚕丝蛋白复合制备蚕丝蛋白/羟基磷灰石复合水凝胶体系，研究结果表明羟基磷灰石的共混有效地模拟了骨的成分，更利于骨细胞的培养。Vasconcelos等［33］将弹性蛋白共混至蚕丝蛋白水凝胶中促进了伤口的愈合。Mandal等［34］制备了蚕丝蛋白/聚丙烯酰胺复合水凝胶，聚丙烯酰胺的复合改善了凝胶体系的亲水性，更加有利于后续细胞培养实验。Hu等［20］采用超声法制备了蚕丝蛋白/透明质酸复合凝胶，研究结果表明透明质酸的共混增加了材料的吸水保水性，提高了凝胶的蓬润性。

表1 高分子材料复合对蚕丝蛋白水凝胶的修饰改性Tab.1 Modification of silk fibroin hydrogels by blending of polymers

综上所述，因蚕丝蛋白本身固有的缺陷，单纯的蚕丝蛋白水凝胶支架应用于生物医用材料常常受到限制，因此将蚕丝蛋白水凝胶与一种乃至多种功能性材料复合是目前以及今后的研究趋势。

4 蚕丝蛋白水凝胶的力学性能

作为生物医用支架材料需拥有良好的力学性能，因此蚕丝蛋白水凝胶的力学性能是在制备蚕丝蛋白水凝胶及其应用过程中需着重考虑的问题。Leisk等［24］研究表明蚕丝蛋白水凝胶较蚕丝蛋白水溶液具有较高的强度和模量，但是由于蚕丝蛋白水凝胶力学强度差、硬脆等问题，极大的限制了蚕丝蛋白水凝胶的应用;因此有必要通过一些物理、化学等方法改善蚕丝蛋白水凝胶的力学性能。

Huang等［27］将功能材料氧化石墨烯共混至蚕丝蛋白水凝胶体系中，研究结果表明控制适当的氧化石墨烯共混比例可以成倍地增加蚕丝蛋白水凝胶的断裂强度。Ghosh等［35］将制备的蚕丝蛋白水凝胶置于采用有机醇(甲醇)处理，研究结果表明，有机醇处理同样可以成倍地增加蚕丝蛋白水凝胶的力学性能。

综上所述，虽然蚕丝蛋白水凝胶较蚕丝蛋白水溶液的力学性能有较大的改善，但仍需通过一定的物理或化学方法进行改善，才能更好地应用于生物医用材料领域。

5 蚕丝蛋白水凝胶快速成型研究

蚕丝蛋白水凝胶作为组织工程之家修复材料需要有良好的结构稳定性、优异的力学性能，上述方法制备的蚕丝蛋白水凝胶存在凝胶成型慢，结构不稳定等问题，因此需要通过特定的快速成型方法来提高蚕丝蛋白水凝胶的结构稳定性。目前国内外有关蚕丝蛋白水凝胶快速成型方法主要有光固化、有机醇处理、环氧树脂固化等。Kundu等［36］制备了蚕丝蛋白/聚乙烯醇复合水凝胶体系，并采用光敏引发剂Irgacure作为中间体，将凝胶体系置于紫外光灯下照射15 min，制备了结构稳定、成型较好的蚕丝蛋白水凝胶体系。Ghosh等［35］将制备的蚕丝蛋白水凝胶置于甲醇中处理，获得了结构较为稳定的蚕丝蛋白凝胶支架。

本文作者也开展了蚕丝蛋白水凝胶快速成型的相关研究，采用电凝胶方法制备了蚕丝蛋白水凝胶体系，并用乙醇处理、紫外光固化等方法研究了蚕丝蛋白水凝胶的快速成型。本文采用流变仪测定了不同蚕丝蛋白体系的储存模量和力学性能(反映了材料的结构稳定性)，结果见图8。由图可见，蚕丝蛋白电凝胶的储存模量要优于蚕丝蛋白水溶液体系，而经乙醇处理后(处理10 min)的蚕丝蛋白水凝胶的储存模量明显高于未经处理的蚕丝蛋白水凝胶，表明经乙醇处理后蚕丝蛋白水凝胶成型较好，结构较稳定。而经紫外光固化后(光固化1 min)的蚕丝蛋白凝胶体系的储存模量要远高于蚕丝蛋白凝胶和经乙醇处理后的凝胶体系，显示出光固化蚕丝蛋白凝胶体系的成型较好、成型速度快且结构稳定。

图8 不同蚕丝蛋白体系的储存模量Fig.8 Storage modulus of different silk fibroin systems

图9 不同蚕丝蛋白体系的力学性能Fig.9 Mechanical properties of different silk fibroin system

图9示出不同蚕丝蛋白体系的力学性能。由图可见，经乙醇处理后的蚕丝蛋白凝胶体系的断裂强度为6.5 MPa，较未经处理蚕丝蛋白水凝胶的断裂强度(3.2 MPa)增加了1倍以上，表明经乙醇处理后蚕丝蛋白水凝胶成型较好，结构较稳定。而经紫外光固化后的蚕丝蛋白水凝胶的断裂强度达到7.8 MPa，较未经处理的蚕丝蛋白水凝胶的断裂强度增加了2倍以上，同样显示出光固化蚕丝蛋白凝胶体系的成型较好、成型速度快且结构稳定。

综合文献分析，蚕丝蛋白水凝胶体系存在制备效率较低、结构(性能)不可控、工序繁琐、费用高昂等缺点，将蚕丝蛋白水凝胶复合体系与当前热门的三维生物打印技术相结合，通过三维生物打印蚕丝蛋白水凝胶，制备结构、尺寸、材料组分可控的蚕丝蛋白水凝胶生物支架材料。主要对蚕丝蛋白水凝胶在打印过程中的快速凝胶成型机制进行研究，着重解决打印过程中凝胶、结构、尺寸、组分以及表面生物兼容性控制与三维打印技术的集成等难点。

6 结语

采用对蚕丝蛋白水溶液旋流剪切、超声振荡、酸处理、浓缩、施加电场等方法可成功制备蚕丝蛋白水凝胶。采用一些功能性纳米材料或功能性高聚物材料对蚕丝蛋白水凝胶进行改性。蚕丝蛋白水凝胶的快速成型是蚕丝蛋白水凝胶应用于组织修复的关键，可采用光固化、有机醇处理、环氧树脂固化等方法来实现蚕丝蛋白水凝胶的快速固化成型。本文详细地介绍了蚕丝蛋白水凝胶的制备方法、凝胶机制、改性处理、快速成型方法，并结合目前本课题组三维生物打印蚕丝蛋白水凝胶制备结构与性能可控的支架材料，为蚕丝蛋白水凝胶更广泛的应用于临床提供了思路。

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