秦 川，陈 林，肖颖彬

（第三军医大学新桥医院全军心血管外科研究所，重庆400037）

促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是机体遭遇缺氧时为缺氧诱导因子（hypoxia inducible factors，HIFs）激活后上调表达的重要细胞因子［1］，其促进红系祖细胞增殖及分化为成熟红细胞，以增加循环血液中红细胞数量及血红蛋白含量，提高血液携氧能力应对缺氧。但近年研究证实，促红细胞生成素受体（erythropoietin receptor，EPOR）能够表达于心肌细胞，提示EPO 能够直接作用于心肌细胞EPOR 产生相关生物学效应。本实验前期研究发现EPO 能够显著增强慢性缺氧环境下培养的H9c2心肌细胞的线粒体生物合成水平，因而可能影响线粒体的能量代谢功能而参与心肌细胞对慢性缺氧的适应过程［2］，然而其信号转导机制仍有待阐明。一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）是NO 合成的主要调节蛋白，通过催化L-精氨酸合成NO，从而启动线粒体生物合成［3］。为此，本研究拟通过采用shRNA 干扰eNOS基因表达的方法观察干预eNOS后对EPO 调节心肌细胞线粒体生物合成作用的影响，从而探讨其可能的信号转导机制。

1 材料与方法

1.1 材料 H9c2心肌细胞（ATCC细胞库）；蛋白磷酸酶抑制剂（普利莱）；eNOS、p-eNOS（ser1 177）抗体（兔抗大鼠；Cell Signaling Technology公司）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳液、BCA 试剂盒、SDS裂解液、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（碧云天公司）；DMEM 高糖培养基、胎牛血清（Gibco公司）；MitoTracker 线粒体绿色荧光探针（Invitrogen公司）；基因组DNA 提取试剂盒、SYBR®Ex TaqTMⅡ试剂盒（TaKaRa公司）；rhEPO（沈阳三生公司）；eNOS shRNA质粒［Nos3-RNAi（2984-1）］由吉凯公司构建。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞慢性缺氧模型建立 采用缺氧培养箱，将H9c2心肌细胞于缺氧环境中（94% N2，5% CO2，1% O2）培养，2d换含10%胎牛血清的培养液1次，培养1周建立慢性缺氧模型。将慢性缺氧H9c2细胞转移至6孔板，细胞数量为5×105个，制作细胞爬片。

1.2.2 eNOS的特异性RNA 干扰 eNOS的特异性shRNA质粒靶序列为：5′-GCG TGG AGT GTT TGG ACA AGT CC-3′。质粒内含有抗新霉素基因用于药物筛选，也含有GFP基因可用于流式细胞仪进一步筛选。采用脂质体法转染细胞，具体如下：当细胞在6孔板内生长至融合率达90%以上时，于每孔加入150μL无血清培养基稀释的12μg质粒DNA（包括空白对照质粒和目的质粒）以及无血清培养基138μL 稀释的转染试剂Lipofectamine 2000 12μL，再加入无血清培养基700 μL，于37 ℃培养24h，荧光显微镜观察转染率为30%～40%。进一步采用流式细胞仪筛选，观察发现转染率升至约70%，改用含新霉素的培养基培养，维持转染率。

1.2.3 分组 未加入rhEPO 的慢性缺氧细胞为缺氧对照组（HC组），以20U／mL 的rhEPO 处理的慢性缺氧细胞为HE组，以20 U／mL rhEPO 处理转染了eNOS的特异shRNA 质粒的慢性缺氧细胞为HR 组。

1.2.4 线粒体荧光探针染色 细胞于缺氧培养1周后，细胞爬片以PBS漂洗3次。将线粒体绿色荧光探针用二甲基亚砜（DMSO）稀释为1mmol／L，再用DMEM 稀释至100mmol／L。将制备好的工作液与细胞爬片于室温孵育25 min后，以激光共聚焦显微镜观察，线粒体数量以绿色荧光光密度值计算。

1.2.5 实时-PCR（RT-PCR） 首先提取处理后的细胞总DNA，以细胞核基因组的β-actin 作为参照基因，细胞色素c（Cyt）作为目的基因。采用Primer Premier 5.0软件对以上基因PCR 引物进行设计，由上海生工合成。Cyt：上游引物5′-CCG GAG CAA TCC AGG TCG GTT-3′；下游引物5′-TGG TTG GGA GCA CTT ATG GTA AGG A-3′，β-actin：上游引物5′-TCC CGG CCC CTA GGG TGT AGA-3′；下游引物5′-GCC GCA CCG GCT CTC CAA AT-3′。采用SYBR Green染色法，于7500Fast RT-PCR系统上进行反应：94℃30s，60℃30s，72 ℃1min，共40个循环。所有的RT-PCR 至少重复3次，溶解曲线验证扩增产物特异性，Cyt为97bp片段，β-actin为136bp片段。采用2-△△CT法［4］计算线粒体相对拷贝数。

1.2.6 Western blot 收集处理过的细胞，加入1mL SDS细胞裂解液，同时加入10μL PMSF及1μL 磷酸化蛋白降解抑制剂，于0 ℃孵育30min，超声破碎，12 000r／min离心5min提取总蛋白。考马斯亮蓝法进行蛋白定量后，将其于8%的SDS-PAGE在100V 下电泳2h。再于250mA 恒流电下100 min电转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。封闭液于室温封闭2h，加入一抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶5 000），室温下空气摇床中摇动100min。采用ECL化学发光法显影，采集图片后以Quantity One软件进行分析，灰度值表示蛋白表达量，以β-actin为参照基因。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0 软件进行数据分析，RTPCR，Western blot结果采用单因素方差分析，结果均满足方差齐性检验，数据采用±s表示，两两比较采用LSD-q法。线粒体数量采用平均光密度值计算，用单因素方差分析为方差不齐，改用独立样本的Kruskal-Wallis检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 eNOS的特异性shRNA 干扰 经过特异性shRNA 质粒转染处理，并经过流式细胞仪筛选，转染率由30%～40%升至约70%。见图1。

图1 eNOS 特异性shRNA 质粒转染后的H9c2心肌细胞（×200）

2.2 线粒体数量变化 同HC 组比较，HE 组绿色荧光强度显著增强，即rhEPO 能显著增加慢性缺氧心肌细胞线粒体数量（P＜0.05），但HR 组线粒体数量较HE 组显著减少（P＜0.05）。见图2。

图2 线粒体荧光探针检测线粒体数量（激光共聚焦显微镜×1 000）

2.3 eNOS蛋白表达及磷酸化变化 同HC组比较，HE 组细 胞经rhEPO 处理后eNOS总蛋白表达无影响，但显著促进其磷酸化（P＜0.05），HR 组心肌细胞eNOS的特异RNA 干扰显著降低eNOS蛋白表达及磷酸化水平（P＜0.05）。见图3。

图3 Western blot检测eNOS蛋白及磷酸化表达水平变化

2.4 线粒体相对拷贝数变化 HE 组线粒体相对拷贝数较HC组增加（P＜0.05），但在HR 组较HE 组减少（P＜0.05）。见图4。

图4 RT-PCR检测线粒体相对拷贝数变化

3 讨 论

先天性心脏病的发病率约为4／1 000～50／1 000［4-5］，其中紫绀型先天性心脏病对儿童健康乃至生命的威胁更为明显。尽管在我国越来越多的紫绀型先心病患者已得到了及时正确的治疗，然而其病死率仍较高，远期疗效也不确定。还有部分患者可能终身无法接受根治手术。慢性缺氧是此类患者的共同病理生理过程。由于心脏高度需氧，因此对缺氧也极为敏感。然而，紫绀型先心病患者的心脏却能够耐受缺氧，生存并发挥功能，其机制亟待研究。缺氧时会造成能量应激，慢性缺氧时，心肌细胞必然发生一系列分子生物学变化，进而适应并生存，其中线粒体作为心肌细胞关键的能量来源，其适应性的变化尤为重要。研究已证实紫绀型先天性心脏病患者的心肌细胞出现了线粒体生物合成显著增强的现象，线粒体生物合成作为线粒体自我复制和更新的重要过程，在慢性缺氧的心肌中出现，提示线粒体生物合成的增强可能是心肌细胞对慢性缺氧适应的重要机制。然而，其调控机制尚不清楚。

EPO 是经典的造血细胞因子，主要用于治疗贫血。近年发现，心肌细胞表达EPOR，提示EPO 可以直接作用于心肌细胞并产生生物学效应，多项研究也对此进行了报道［6-8］。由于在慢性缺氧时循环血液中EPO 的浓度显著升高［9］，同时心肌中的EPOR 表达也显著增加［10-11］，提示心肌细胞EPO-EPOR信号增强，然而其生物学效应尚不明确。本实验前期对EPO调节慢性缺氧心肌细胞线粒体生物合成的作用进行了研究，发现EPO 显著增强慢性缺氧心肌细胞线粒体生物合成水平，且呈剂量依赖性。

在本研究中，通过采用eNOS的特异性RNA 干扰，首先发现EPO 对慢性缺氧心肌细胞eNOS的总蛋白表达水平没有显著影响，但却显著增强其磷酸化，提示EPO 可以通过使eNOS磷酸化的途径使之激活，推测这一作用与Akt的活化有关，因为eNOS的1 177Ser为Akt磷酸化位点［12］。进一步的研究发现，RNA 干扰使eNOS的蛋白表达及磷酸化水平显著降低，同时，也使EPO 增强慢性缺氧心肌细胞线粒体生物合成的作用显著减弱，证实了eNOS通过磷酸化活化参与了EPO 调节慢性心肌细胞线粒体生物合成的效应。

通过本研究，作者进一步深入探讨了EPO 调节慢性缺氧心肌细胞线粒体生物合成的作用机制，对深入阐释增强的EPO-EPOR信号在心肌细胞对慢性缺氧适应中作用以及心肌对慢性缺氧环境适应机制具有一定的意义。

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