张艳霞，高天旸，李梅清，周长华，陈 哲，全 燕，赵雪峰，李 锐

（1.南华大学附属第二医院妇产科，湖南衡阳421001；2.南华星辉生殖健康专科医院生殖中心，湖南衡阳421001；3.广东省第二人民医院生殖中心，广东广州518037；4.南华大学附属第二医院呼吸内科，湖南衡阳421001）

反复自然流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指连续两次及以上的自然流产，发生率约占总妊娠数的5%。RSA 的发病原因复杂，包括解剖、内分泌、染色体异常、感染、环境理化因素的影响等。其中15%～50%的RSA 找不到原因，称为不明原因反复自然流产（URSA），近代生殖免疫的研究提示多数系同种免疫异常所致，即类似于同种移植排斥反应。研究证实，1型辅助T 淋巴细胞与2型辅助T 淋巴细胞的比值（Th1／Th2）平衡向Th1偏移，NK 细胞、调节性T 细胞功能异常，树突状细胞功能异常等均可能导致母胎免疫平衡破坏，导致流产［1］。

树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞（APC），是机体免疫反应始动者［2］，参与了调节性T 细胞的诱导分化［3］、NK 细胞的激活及Th1／Th2之间平衡的调节［4］，因此DC 对妊娠的维持具有重要意义。人的DC可分为髓样DC（myeloid dendritic cell，MDC）亚群和浆细胞样DC（plasmacytoid dendritic cell，PDC）亚群。MDC 经激活能产生大量IL-12，使Th0分化为Th1细胞［5-6］，而PDC有利于Th0分化为Th2细胞［5，7-8］。Th1型细胞因子具有胚胎毒性作用，而Th2型细胞因子对正常妊娠的维持起重要作用。妊娠时期的免疫调节作用不仅发生于母体全身免疫系统，而且也发生在妊娠子宫局部，这种局部免疫因素的调节作用更直接地影响着母胎之间的相互作用。也有观点认为胎儿从未与母体组织直接接触，因此母胎免疫调控机制可能仅发生于胎盘的母胎界面处［9］。DC主要分布于皮肤和黏膜等表面组织，在黏膜表面抗原的免疫应答的启动和调节过程中起了举足轻重的作用。蜕膜是一种特殊的黏膜组织，蜕膜DC 被认为在维持母胎免疫调控中发挥着关键作用［4，10］。

因此，本研究拟通过检测URSA 患者与正常计划外妊娠人流妇女蜕膜组织中DC 亚群的变化，探讨DC 亚群在URSA中的作用。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 URSA 组：研究对象为2012年5月至2013年5月于广东省第二人民医院妇科、生殖医学科门诊就诊的妊娠12周内、B超提示胚胎停止发育的URSA 患者22例，年龄19～37岁，平均（28.3±5.2）岁，孕次2～5次。所有患者均在流产前或后进行病因筛查，入选者需符合以下条件：（1）女方无生殖道畸形；（2）优生4项（TORCH）检查为阴性；（3）月经周期正常；（4）性激素、甲状腺功能、空腹血糖、胰岛素等内分泌检查均正常；（5）抗心磷脂抗体、抗核抗体（ANA）等自身免疫抗体阴性；（6）衣原体、支原体等检查排除生殖道感染；（7）无血型不合或抗体效价小于1∶128；（8）男方精液常规检查正常；（9）夫妇双方染色体检查正常，排除家族遗传病史。对照组选取同期年龄及孕次、孕周相匹配的因计划外妊娠要求人工流产的正常妊娠妇女20例，年龄21～37岁，平均（28.0±5.5）岁，孕次2～4次。须符合以下条件：（1）无自然流产、死产、死胎等异常孕育史；（2）无解剖结构、内分泌等方面的异常；（3）无感染、自身免疫性疾病史，本次妊娠期间无阴道流血、腹痛等先兆流产症状和体征；（4）B超检查显示胚胎发育正常。

1.1.2 主要试剂与仪器 LIN1-FITC、FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD 公司。PerCP-Cy5.5 抗人HLA-DR、PE 抗人CD123、APC 抗人CD11c、PerCP-Cy5.5 鼠IgG2bIsotype Control、PE 鼠IgG1、APC 鼠IgG1 均 购 自 美 国eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 无菌方法采集人工流产负压吸引蜕膜组织，将收取的蜕膜组织立即置于冰块预冷的RPMI1640培养液中，迅速运回实验室。标本采集经广东省第二人民医院伦理委员会批准及患者本人知情同意。

1.2.2 蜕膜单个核细胞的分离 新鲜蜕膜组织用无菌PBS漂洗2～3次，剪碎成约1mm3左右的组织块，置于120目滤网上，用20mL橡皮针栓研磨。收集通过滤网的细胞悬液，再过200目滤网。收集通过200 目滤网的细胞悬液，800r／min离心10min。弃上清，用PBS重悬细胞后，将细胞悬液以1∶1体积平铺于淋巴细胞分离液上，4 ℃2 000r／min离心25min。吸出中间的淋巴细胞层，加入1×PBS缓冲液，800r／min离心10min。弃上清，再加入PBS 重悬细胞，800r／min 离心10 min。弃上清，加入少量PBS重悬细胞，进行细胞计数、调整细胞浓度为1×106／L，待用。

1.2.3 DC亚群的测定 （1）单克隆抗体标记：取Falcon离心管，取100μL上述待用的单个核细胞，加入抗人LIN1-FITC抗体20μL，PerCP-Cy5.5 抗人HLA-DR 抗体10μL，APC 抗人CD11c抗体5μL，PE抗人CD123抗体5μL，振荡混匀后室温避光孵育25min。同时设置同型对照管。（2）加入PBS漂洗2次，300×g离心5 min，弃上清。（3）轻轻混匀，加入300 μL PBS。（4）2～8 ℃避光保存，24h内上机分析。

1.2.4 流式细胞仪分析 全部数据经FACS Calibur流式细胞仪和CELLquest软件获取，获取5×104个细胞。使用FSC／SSC点图，画R1，排除碎片和死细胞。找到淋巴细胞系列抗原LIN1弱阳性和阴性群体，使用抗HLA-DR／LIN1 点图（G1＝R1），画R2，圈定LIN1弱阳性和阴性及抗HLA-DR 阳性细胞群，该群细胞界定为DC。使用CD11c／CD123点图（G2＝R2）区分CD123＋及CD11c＋细胞群分别为PDC及MDC。

1.3 统计学处理 用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料采用±s表示，行方差齐性检验后，采用独立样本t检验对数据进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

URSA 组蜕膜中DC、MDC、PDC、MDC／PDC 的水平与对照组比较均显著增高（P＜0.05），见表1、图1。

表1 两组蜕膜树突状细胞亚群比较（±s，n＝20，%）

表1 两组蜕膜树突状细胞亚群比较（±s，n＝20，%）

项目 对照组 URSA 组t P DC／MNC 1.01±0.10 2.05±0.15 26.90 0.000 MDC／MNC 0.67±0.07 1.43±0.12 24.70 0.000 PDC／MNC 0.06±0.02 0.11±0.02 10.05 0.000 MDC／PDC 11.04±2.81 12.87±1.70 2.58 0.014

图1 两组患者蜕膜DC亚群流式细胞分析图

3 讨 论

DC是目前已知的功能最强的APC，也是体内惟一能直接激活初始T 细胞的APC。不仅可以通过诱导T 细胞无能及克隆清除、分泌细胞因子及诱导调节性T 细胞的扩增等方式来诱导免疫耐受［11-12］，在某些理化因素、内环境改变及致炎因子的影响下，亦可以激活效应T 细胞，产生免疫应答［13］。DC 产生免疫耐受还是免疫应答主要取决于其亚群分化、成熟度及其分泌的细胞因子的模式等。DC 依据来源不同可分为MDC 和PDC。DC亚群的不同，其功能亦存在差异。MDC 表达髓系抗原CD11c，与单核巨噬细胞有共同的前体细胞，可分泌IL-12，使Th0细胞向Th1细胞分化，介导Th1型免疫应答，对胚胎具有细胞毒性；PDC来源于淋巴样干细胞，缺乏髓系标志物，但可表达CD123，可分泌IL-4、IL-10，使Th0细胞向Th2细胞分化，介导Th2型免疫应答，有利于妊娠的维持［14］。同时PDC由于具有诱导Th细胞凋亡的能力而被认为具有免疫耐受功能［15］。

母体蜕膜组织和胎盘滋养层组织共同构成的母-胎界面是妊娠免疫耐受的基础。蜕膜是母体与胎儿成分密切接触的部位，妊娠早期蜕膜含有大量白细胞，包括蜕膜NK 细胞、DC、单核巨噬细胞和T 细胞等，这些白细胞之间互相作用形成一个复杂的网络。Abraham 等［15］于2000年发现了人类蜕膜DC的存在，并首次对其超微结构等进行了详细的描述。另外一些学者［4，10，16］也证实，人类早期妊娠的蜕膜中存在DC。Blois等［17］研究发现，在小鼠的整个妊娠过程中子宫蜕膜中均有DC存在，进而推测DC可能在母胎界面的免疫调节中发挥重要作用。大量文献表明，蜕膜DC亚群可能在正常妊娠维持母胎免疫调控中发挥着关键作用［4，10］。

目前已有共识，Th1／Th2型细胞因子的平衡对妊娠的维持起重要作用。而初始Th细胞（Th0）激活并向Th2 或Th1分化需要APC的参与。DC 广泛分布于皮肤、消化道、呼吸道黏膜等机体防御第一线，其功能独特之处在于全身所有APC中惟有DC 才能激活初始型T 细胞，是识别内外抗原，调节免疫功能，维持机体稳定的关键因素。在母胎界面，母体保护胎儿的免疫耐受与防御病原体的免疫反应之间的平衡对正常妊娠的维持起关键作用。目前DC 可调节免疫耐受及激发免疫应答的双重功效也被认可，Kammerer等［18］对早孕子宫蜕膜中具有DC 形态特征的细胞进行研究发现，早孕蜕膜中存在CD83＋细胞，而CD83＋被认为是DC成熟的标志。与外周血一样，蜕膜CD83＋细胞富集后能够进行混合淋巴细胞反应，说明其也有免疫活性，提示在某些致炎因素的影响下，DC 也可以产生免疫应答，进而使胚胎被排斥，导致流产。虽然目前关于树突状细胞与妊娠免疫耐受的研究较多，但大部分都限于正常妊娠，对于流产与DC相关的研究目前报道较少。

本研究发现URSA 组与对照组比较，自然流产患者其DC、MDC均较对照组显著性增高，MDC／PDC 比值明显增加，而蜕膜中的MDC增加尤为明显，因此推测在URSA 患者中由于MDC、MDC／PDC的增加，以MDC 亚群占优势，使IL-12等Th1型细胞因子分泌增加，IL-10 等Th2 型细胞因子分泌减少，导致Th1／Th2 型细胞因子的平衡向Th1 型细胞因子偏移，使胚胎遭到免疫攻击，导致流产。因此，MDC 和PDC 含量的差异可能导致母体免疫反应是倾向于免疫排斥还是免疫耐受。DC亚群的这一变化可能与自然流产有相关性。

母胎免疫耐受的维持不是由一个或几个独立机制所调控，免疫调节是一种精细、复杂的现象，是由多细胞、多种机制共同参与、互相制约、稳定协调的动态平衡过程。积极探索DC 在妊娠中的作用机制，对解决器官移植排斥反应及免疫性病理妊娠的治疗等具有重要意义。

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