陈 莹,胡正海,胡本祥,沈 霞,颜永刚

(1 陕西中医学院 药学院,陕西咸阳 712046;2 西北大学 西部资源生物与现代生物技术省部共建教育部重点实验室,西安 710069)

杭白芷根的分泌道超微结构与其挥发油分泌的关系

陈 莹1,胡正海2,胡本祥1,沈 霞1,颜永刚1

(1 陕西中医学院 药学院,陕西咸阳 712046;2 西北大学 西部资源生物与现代生物技术省部共建教育部重点实验室,西安 710069)

利用光镜及透射电子显微镜技术研究了杭白芷根中分泌道结构及其挥发油的分泌,并重点探讨分泌道中挥发油的分泌过程。结果显示:(1)杭白芷的分泌道是由上皮细胞围绕着的伸长的胞间隙,腔道内贮存着挥发油。(2)分泌道细胞的质体、细胞基质以及线粒体参与挥发油或其前体物质的合成。(3)在分泌道发育的后期,大量小泡与分泌细胞的液泡膜和细胞质膜融合,将其内的物质释放进入空腔。研究认为,杭白芷分泌道中挥发油主要合成部位为质体及细胞基质,之后以扩散渗透或通过膜质小泡与液泡及质膜融合这两种方式分泌到空腔内,丰富的线粒体可能为这一系列过程提供能量。

杭白芷;发育;分泌道;挥发油;分泌

中药白芷为伞形科植物白芷[Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f]或杭白芷[Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.var.formosanaBoiss.Shan et Yuan]的干燥根[1],始载于《神农本草经》,因初生根杆为芷,色白,故名白芷,是一种临床常用的解表药,在治疗各种类型的疼痛症状中出现的频率相当高。现代所用的白芷均为栽培品,以四川、河北、河南、浙江为四大历史产区[2]。近年来有关白芷化学成分及药理作用方面的研究已比较深入,以川白芷、杭白芷、祁白芷报道最多[2-4]。而其主要的入药部位是根,其主要的药用成分如挥发油、黄酮类等在根中产生,但其积累和分泌过程尚不清楚。虽然目前多数文献报道杭白芷根中有分泌腔分布,杭白芷分泌结构究竟是分泌道还是分泌腔？分泌结构中挥发油究竟如何分泌？本研究通过透射电镜技术对杭白芷根中分泌道的超微结构以及发育过程中挥发油的分泌过程进行了系统研究,以期为探讨分泌道的超微结构与挥发油分泌的关系提供依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

分别于2012、2013年在陕西中医学院药学院药草园内,采集一年生和二年生杭白芷植株的根、茎、叶为试验材料。

1.2 方 法

1.2.1 石蜡切片法和组织化学法 利用石蜡切片法对白芷不同营养器官在分泌道结构及分布进行观察,取白芷不同部位(根、茎、叶)分割成0.5～1.0 cm长的片段,以FAA固定,常规石蜡切片,厚度5～10 μm,番红-固绿染色,中性树胶封片,Leica DMLB显微镜观察并照相。利用苏丹Ⅲ溶液进行挥发油的组织化学定位,取新鲜的白芷根,制备徒手切片,切片厚度约50 μm,以苏丹Ⅲ溶液染色后稍加热,然后用稀甘油处理,Cx21Fs1型(日本OLYMPUS)显微镜观察并照相。

1.2.2 半薄切片法 利用半薄切片法对白芷根中分泌道进行观察,取不同发育时期的杭白芷的根,分割成0.5×0.5×1 mm的小块,固定于4%戊二醛(0.1 mol/L磷酸缓冲液配制,pH 7.2)中,低温4 ℃固定,过夜,缓冲液冲洗,1%锇酸室温后固定2 h,缓冲液冲洗,系列酒精脱水,环氧丙烷过渡,Epon812环氧树脂包埋,Reichert-Jung切片,切片厚1～2 μm,TBO染色[5],Leica DMLB显微镜观察并照相。

1.2.3 超薄切片法 上述材料Leica EM UC6切片机切片,切片厚70～90 nm,醋酸铀和柠檬酸铅染色,H-7650(Hitachi,Japan)透射电镜下观察分泌细胞超微结构并照相。

2 观察结果

2.1 杭白芷分泌道的光镜结构及分布

杭白芷的分泌道是由分泌细胞围绕着的伸长的胞间隙(图版Ⅰ,1、2),腔道内贮存着挥发油(图版Ⅰ,3)。在杭白芷根、茎、叶中均有分泌道存在。在根中,分泌道主要分布在中柱鞘薄壁组织和次生韧皮部中(图版Ⅰ,4);在茎中,主要存在于皮层和髓中(图版Ⅰ,5、6);在叶中,主要存在于叶脉薄壁组织中(图版Ⅰ,7)。杭白芷根的初生结构无分泌道(图版Ⅰ,8),因此杭白芷根中分泌道属于次生分泌道,而茎中分泌道主要分布于皮层和髓中,且多存在于木质部和韧皮部相对处,在叶中分泌道分布在维管束的上、下组织中,这些分泌道均属初生分泌道。

2.2 分泌道的超微结构观察

杭白芷中成熟的分泌道是由一层分泌细胞和空腔所构成,周围没有鞘细胞。早期分泌细胞与周围细胞的差别不大,体积较小。随后分泌细胞细胞壁之间逐渐相互分离,形成空腔(图版Ⅱ,1)。此时分泌细胞仍具有明显的细胞学特征:细胞质浓厚,具小液泡,同时具有明显的细胞核,细胞壁薄,质体丰富且质体中含有高电子密度物质(图版Ⅱ,1、2)。之后空腔逐渐扩大,分泌细胞也发生改变,小液泡逐渐融合形成较大液泡,有明显的线粒体、内质网及质体(图版Ⅱ,3、4),质体中有灰黑色的嗜锇滴(图版Ⅱ,4),同时,高电子密度物质也出现在空腔和液泡中(图版Ⅱ,5、6)。同时,在质体中嗜锇滴附近出现膜系统降解的类囊膜鞘结构,质体周围出现大量高电子密度黑色团块(图版Ⅱ,7),液泡内一些嗜锇滴周围也围绕着大量黑色团块(图版Ⅱ,8),与质体周围的高电子密度物质类似(图版Ⅲ,1)。随着分泌道扩大,大液泡不断增大,占据了细胞的大部分,细胞核、质体、线粒体、内质网均可见(图版Ⅲ,2～5),在空腔内和液泡内进一步积累大量高电子密度物质(图版Ⅲ,2、3),同时液泡内出现同心环状的膜结构,包围着黑色团块(图版Ⅲ,6),液泡周围存在大量线粒体(图版Ⅲ,7)。随后,在空腔及液泡周围出现大量由膜包被的黑色团块物质(图版Ⅲ,8;图版Ⅳ,1),并且这些膜质小泡与液泡膜和质膜逐渐融合并释放其内容物(图版Ⅳ,2～4)。进入成熟期,成熟的分泌道是由一层分泌细胞构成,没有鞘细胞,此时各细胞器已被大液泡挤到紧贴质膜的位置,细胞器的数量也减少直至消失。到分泌道发育的后期,小泡内的物质减少并与质膜开始融合(图版Ⅳ,5),同时分泌细胞中细胞器数量减少,质体、高尔基体被大液泡挤到质膜附近(图版Ⅳ,4、6、7),细胞核出现内折现象(图版Ⅳ,8)。

3 讨 论

大量文献中报道白芷根中存在分泌腔或油室,根据本实验从杭白芷根的纵切面上来看,其分泌结构呈长管状,应属于分泌道。整个发育过程中没有观察到细胞破毁,空腔形成是由分泌细胞细胞壁之间逐渐相互分离而来的,因此,白芷根中分泌道应属于裂生型,与Fahn[6]对伞形科分泌组织的描述一致。而超微结构观察结果表明,分泌道与挥发油合成和分泌存在密切关系。精油的生化研究表明,它是植物次生代谢产物,主要是含有挥发性的分子量小的萜类物质成分[6],分为单萜、倍半萜、二萜等几类。单萜是由单萜合成酶或环化酶催化牦牛儿苗基二磷酸(GPP)的合成反应而来的,众多的研究均表明质体是其专一性的合成部位[7]。由于倍半萜合成酶位于细胞质中,其性质与单萜合成酶相似。因而FPP及倍半萜的合成,一般认为是在细胞溶质及内质网与细胞溶质的交界面处[8-9]。二萜合成酶的基本性质与单萜和倍半萜合成酶性质相似,合成也在质体上[7]。结合本实验在杭白芷中的观察结果,在分泌道发育过程中,嗜锇滴及黑色团块物主要分布在质体和细胞质,因此,精油的主要合成部位为质体和细胞质。这些观察与生化合成的研究结果是基本一致的,同时,在上述精油合成、加工和转运过程中,有大量线粒体存在,丰富的线粒体可能为这一系列过程提供能量,同时看到大量膜质小泡包裹黑色团块物质并与液泡膜和细胞质膜融合,说明膜质小泡与精油分泌的关系密切,而且在分泌细胞内可见高尔基体及内质网降解形成的同心环状膜结构,说明高尔基体和内质网也可能参与了膜质小泡的形成,帮助细胞完成转运过程。杭白芷根中分泌道的分泌细胞中精油主要合成部位是质体和细胞质,之后以扩散渗透或通过膜质小泡与液泡及质膜融合这两种方式分泌到空腔内,类似的结果在蔡霞等[10]对北柴胡分泌道中挥发油分泌的研究也有报道,这为探讨伞形科植物精油合成场所和转运提供了更多的细胞学证据,生化途径和机制还有待进一步研究。

[1] ZHANG Q ZH(张庆芝),WANG K J(王开疆).The species of RadixAngelicaedahuricae[J].JournalofYunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine(云南中医学院学报),2000,23(2):22-24(in Chinese).

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:303-305.

[3] CHEN Y(陈 莹),LI T T(李婷婷).Advances on the study of biology and chemical constituents ofAngelicadahurica[J].SubtropicalPlantScience,2012,41(4):79-82(in Chinese).

[4] HE K J(何开家),ZHANG H Q(张涵庆).The research progress in chemical composition and pharmacological action ofAngelicaedahuricae[J].ResearchandPracticeonChineseMedichines(现代中药研究与实践),2008,22(3):59-62(in Chinese).

[5] XU L Y(徐丽云),HU SH Y(胡适宜).Dyed epoxy thick slices[J].ChineseBulletinofBotany,1986,4:108-110(in Chinese).

[6] FAHN A.Secretory Tissue in Plants[M].London:Academic Press,1979.

[7] KLEINIG H.The role of plastids in isoprenoid biosynthesis[J].Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.,1989,40(1):39-59.

[8] GLEIZES M,CARDE J P,PAULY G,etal.Invivoformation of sesquiterpene hydrocarbons in the endoplasmic reticulum of pine[J].PlantSci.Lett.,1980,20(2):79-90.

[9] BELINGHERI L,PAULY G,GLEIZES M,etal.Isolation by an aqueous two-polymer phase system and identification of endomembranes fromCitrofortunellamitisfruit for sesquiterpene hydrocarbon synthesis[J].PlantPhysiol.,1988,132(1):80-85.

[10] CAI X(蔡 霞),ZHOU Y F(周亚福),HU ZH H(胡正海).Ultrastructure and secretion of secretory canals in vegetative organs ofBupleurumchineseDC.[J].JournalofMolecularCellBiology(分子细胞生物学报),2008,41(2):96-106(in Chinese).

图版说明:

SC.分泌道;SP.次生韧皮部;SX:次生木质部;VB.维管束;Ph.韧皮部;X.木质部;E.表皮;C.皮层;CC.中柱;L.空腔;M.线粒体;N.细胞核;P.质体;V.液泡;Ms.类囊膜鞘结构;G.高尔基体

Explanation of plates:

SC.Secretory canals;SP.Secondary phloem;SX.Secondary xylem;VB.Vascular bundles;Ph.Phloem;X.Xylem;E.Epiderm;C.Cortex;CC.Central cylinder;L.Lumen;M.Mitochondria;N.Nucleolus;P.Plastid;V.Vacuole;MS.Myelin-like structures;G.Golgi apparatus

图版 Ⅰ 1.白芷根纵切,×400;2.白芷根横切,×400;3.白芷根横切,苏丹Ⅲ染色,×100;4.白芷根横切,示次生结构,×100;5.白芷茎横切,示茎初生结构,×100;6.白芷茎横切,示维管束×400;7.叶横切,示叶片结构,×400;8.根尖横切,示根的初生结构,×400。

Plate Ⅰ

Fig.1.Longitudinal section of the root,×400;

Fig.2.Cross section of the root,×400;

Fig.3.Cross section of the root staining with Sultan Ⅲ,×100;

Fig.4.Cross section of the root showing secondary structure,×100;

Fig.5.Cross section of the stem showing primary structure,×100;

Fig.6.Cross section of the stem showing vascular bundle,×400;

Fig.7.Cross section of the leaf showing primary structure,×400;

Fig.8.Cross section of the root tip showing primary structure,×400.

图版 Ⅱ 1.分泌道早期;2.分泌细胞,示细胞核;3.分泌道,示空腔形成;4.分泌细胞,示各细胞器;5.空腔中出现高电子密度物质;6.液泡中出现同心环状膜结构;7.质体中出现类囊膜鞘结构;8.液泡中出现黑色团块物。

Plate Ⅱ

Fig.1.TEM micrographs of secretory initial cells;

Fig.2.Secretory cells,showing nucleolus;

Fig.3.A developing secretory canal,showing lumen;

Fig.4.Secretory cells,showing mitochondria,plastid;

Fig.5.Part of a secretory cells,showing osmiophilic droplet in lumen;

Fig.6.Part of a secretory cells,showing vacuole with concentric ring structure;

Fig.7.Plastid which have myelin-like structures;

Fig.8.Vacuole which have diffusion-shaped black masses which instruct with the five-pointed star.

图版 Ⅲ 1.膜质小泡;2.空腔中积累大量高电子密度物质,示细胞核;3～5.各细胞器,线粒体、质体及高尔基体;6.同心环状结构;7.大液泡将细胞器挤向一侧;8.膜质小泡。

Plate Ⅲ

Fig.1.Vesicles in cytoplasm;

Fig.2.Showing the lumen with numerous osmiophilic droplets;

Fig.3-5.Secretory cells,showing mitochondria,plastid,dictyosome;

Fig.6.Concentric ring structure in vacuole;

Fig.7.Part of a developing secretory canal,showing a large center vacuole in a secretory cell;

Fig.8.Vesicles in vacuole.

图版 Ⅳ 1.空腔中出现膜质小泡;2.膜质小泡释放内容物;3.膜质小泡与液泡膜融合;4.膜质小泡内容物减少;5.不规则的膜质小泡;6.细胞器紧贴质膜;7.高尔基体;8.细胞核内折。

Plate Ⅳ

Fig.1.Vesicles in lumen;

Fig.2.Vesicles releasing content;

Fig.3.The fusion of vesicles with vacuole membrane;

Fig.4.Vesicle which have decreasing content;

Fig.5.Vesicles becoming irrugular;

Fig.6.Close to the plasma membrane organelles;

Fig.7.Showing the golgi apparatus nearing cell wall;

Fig.8.Showing the folded nucleus.

(编辑:潘新社)

Relationship between Ultrastructure and Secretion ofSecretory Canals in Root ofAngelicadahurica

CHEN Ying1,HU Zhenghai2,HU Benxiang1,SHEN Xia1,YAN Yonggang1

(1 College of Pharmacy,Shaanxi-University of Chinese Medicine,Xianyang,Shaanxi 712046,China;2 Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Westen China,Ministry of Education,Northwest Unicersity,Xi’an 710069,China)

The ultrastructure of secretory canals in root ofAngelicadahuricaand the accumulation of essential oils were investigated by transmission electron microscopy (TEM) analysis.The secretion process of the essential oil was also discussed.The results indicate that the plastid,ground substances of cytoplasm and mitochondria took part in the biosynthesis of oil or oil precursor.At latter stages of development of secretory cells,numerous different sized vesicles fused with the plasmalemma and tonoplast and released the inner materia into the lumen of secretory canals.As a result,plastid and ground substances of cytoplasm were the major synthetic site of volatile oil which secreted into the lumen by diffusion or by vesicles fusing with the plasmalemma and tonoplast.Abundant mitochondria may provide energy for the series of process.

Angelicadahurica;development;secretory canal;essential oil;secretion

1000-4025(2015)04-0716-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0716

2014-08-30;修改稿收到日期:2015-01-19

国家自然科学基金(81102758);陕西省自然科学基金(2013JQ4012)

陈 莹(1981-),女,博士,讲师,主要从事药用植物结构发育研究。E-mail:chenying029@163.com

Q944.5

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