刘芳茗，胡耀辉*，隋 新

(1．吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118;2．吉林化工学院生物与食品工程学院，吉林吉林132022)

黑木耳隶属木耳目、木耳科、木耳属［1］，是生长于朽木之上的一种营养丰富的药、食两用真菌，是药品与保健食品开发的新来源［2］．黑木耳多糖对机体免疫功能有明显的促进作用，除此之外还有抗凝血抗血栓、降血脂降血糖、抗衰老抗肿瘤、抗氧化等功能［3-7］．资料表明液态深层发酵获得的多糖含量远高于子实体，有很高的科研价值［8］．目前，唐青涛［9］、肖彩霞［10］、王国良［11］等人采用正交试验的方法对黑木耳深层发酵产多糖培养基进行了优化．作为真菌的一种，黑木耳是维生素B2天然缺陷型，维生素B2以一种辅酶的形式存在，需要少量外部添加才能生长良好．本文研究了维生素B2的添加量，并用响应面法研究了碳源、氮源、无机盐、维生素B2的交互作用对于黑木耳液态深层发酵的影响，优化了培养基配方，为进一步产业化生产提供了有力的依据．

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

菌种:黑木耳为黑-29品种，由吉林农业大学菌物研究所提供．

仪器:立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，垂直净化工作台(苏州净化设备有限公司)，电热鼓风干燥箱，低速离心机(湖南户康离心机有限公司)，全温摇瓶柜(太仓市试验设备厂)．

1.2 试验过程

1．2．1 培养方法

种子液的培养从黑木耳菌种斜面上用接种针钩取少许移入到装有80 mL种子培养基的容积为250 mL的三角瓶中，28℃，150 rpm条件下培养5 d．

发酵培养将液体种子以10%的接种量，接入装有80 mL液体菌种培养基的容积为250 mL的三角瓶中，28℃，150 rpm条件下培养7 d．

1．2．2 液体发酵培养基的优化

(1)碳源种类、浓度的筛选试验分别用葡萄糖、蔗糖、大米粉、可溶性淀粉、玉米粉以30．00 g/L的添加量代替基础培养基的碳源，比较胞外多糖产量．经过试验，选择玉米粉浓度为 10．00、20．00、30．00、40．00 和 50．00 g/L，考察玉米粉浓度对于胞外多糖产量的影响．

(2)氮源种类、浓度的筛选试验分别用豆饼粉、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、麸皮以10．00 g/L的添加量代替基础培养基的氮源，比较胞外多糖产量．经过试验，选择酵母浸粉浓度为6．00、8．00、10．00、12．00 和 14．00 g/L，考察酵母浸粉浓度对于胞外多糖产量的影响．

(3)无机盐浓度的筛选试验磷酸二氢钾与硫酸镁以2 1的比例组成混合无机盐，分别考察混合无机盐浓度为3．00、4．50、6．00、7．50 和9．00 g/L时对于胞外多糖产量的影响．

(4)维生素B2浓度的筛选试验分别考察维生素 B2 浓度为 20．00、40．00、60．00、80．00 和100．00 mg/L，对于胞外多糖产量的影响．

(5)响应面优化设计根据单因素试验结果，选择玉米粉、酵母浸粉、磷酸二氢钾和硫酸镁、维生素B2为考察因素，单因素试验得出的各最佳条件为中心点，选择四因素三水平Box-Behnken设计表，用响应面法优化黑木耳液态深层发酵培养基配方．

1．2．3 检测方法

发酵液4 000 rpm离心10 min后的上清液浓缩至原体积的1/5，加入3倍体积的95%的酒精，4℃沉淀24 h，离心后沉淀60℃真烘干至恒重，Sevage法［12］除蛋白后称重得粗胞外多糖重量．

2 结果与讨论

2.1 碳源种类、浓度的影响

不同碳源对黑木耳深层发酵胞外多糖产量的影响见图1．

图1 碳源种类对黑木耳液态深层发酵产胞外多糖的影响

由图1可知不同碳源对于黑木耳深层发酵胞外粗多糖产量的影响各异．以玉米粉为碳源胞外粗多糖产量最高，蔗糖、可溶性淀粉其次，葡萄糖最小．因此采用价格低廉的玉米粉作为碳源，并对不同玉米粉浓度进行筛选试验，结果表明30．00～40．00 g/L为最适添加量．

2.2 氮源种类、浓度的影响

不同氮源对黑木耳深层发酵胞外多糖的影响见图2．

由图2可知不同氮源对于黑木耳深层发酵胞外粗多糖产量的影响各异．以酵母浸粉为氮源胞外粗多糖产量最高，并对不同酵母浸粉浓度进行筛选试验，结果表明10．00 g/L为最适添加量．

图2 氮源种类对黑木耳液态深层发酵产胞外多糖的影响

2.3 无机盐浓度的影响

不同无机盐浓度对黑木耳深层发酵胞外粗多糖产量的影响见图3．

图3 无机盐浓度对黑木耳液态深层发酵产胞外多糖的影响

由图3可知6．00 g/L的添加量胞外粗多糖产量最高，即磷酸二氢钾与硫酸镁的浓度分别为4．00 g/L 和2．00 g/L．

2.4 维生素B2浓度的影响

不同维生素B2浓度对黑木耳深层发酵胞外粗多糖产量的影响见图4．

图4 无机盐浓度对黑木耳液态深层发酵产胞外多糖的影响

由图4可知80．00 mg/L的添加量胞外粗多糖产量最高．

2.5 响应面法优化培养基配方

采用四因素三水平的响应面进行分析法，考察各因素的交互作用，试验因素及水平设计见表1，试验设计结果见表2．

表1 响应面试验因素及水平设计表

表2 响应面试验设计与结果

经Design-Expert8．0．5软件对黑木耳液态深层发酵产胞外粗多糖的产量进行分析，得到二次模型回归统计分析表见表3．

表3 响应面方差分析结果

从方差分析表中可以看出，x1、x1x2项差异显著，x2、x3、x2x4以及各因素的平方项差异极显著，建立的回归方程如下:

Y= － 69．18+1．85x1+1．89x2+14．42x3+0．20x4+0．04x1x2－0．08x2x3+0．02 x2x4－0．02 x3x4－0．03－0．22－2．01，该方程决定系数R2=0．941 2，修正决定系数 Adj．R2=0．882 4，说明该模型能对试验数据进行较好的拟合，可以预测实际生产．

此外，由于F值越大代表因素对于试验的指标越重要，由表3可知:x2＞x3＞x1＞x4，即培养基中各组分对于黑木耳液态深层发酵产胞外粗多糖的影响程度大小:酵母浸粉＞无机盐＞玉米粉＞维生素B2．

图5 玉米粉与酵母浸粉交互影响黑木耳胞外多糖响应面图

图6 维生素B2与酵母浸粉交互影响黑木耳胞外多糖响应面图

图7 胞外多糖与玉米粉水平、酵母浸粉水平等高线图

图8 胞外多糖与维生素B2水平、酵母浸粉水平等高线图

进行响应面最优分析可知，对于黑木耳液态深层发酵产胞外多糖，玉米粉和酵母浸粉的交互作用显著，维生素B2和酵母浸粉的交互作用极显著．根据回归方程绘制的响应面和等高线如图5～8，可以更加直观地反映出其交互作用．等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反．

3 结 论

通过单因素试验设计，采用Box-Behnken设计建立了黑木耳黑木耳液态深层发酵胞外粗多糖产量与四个关键因子的二次多项式回归模型，经检验证明该模型是合理可靠的．利用模型的响应面分析黑木耳胞外粗多糖得率的关键因子及其相互作用．通过模型系数显著性检验，得到因素的主效应关系:酵母浸粉＞无机盐＞玉米粉＞维生素B2．维生素B2虽然不是影响黑木耳液态深层发酵产胞外多糖的主要因素，但与酵母浸粉的交互作用极显著．最终得到优化培养基组成为:葡萄糖36．78 g/L，酵母浸粉11．23 g/L，无机盐6．10 g/L，维生素B286．06 mg/L;在此条件下可得到胞外多糖的最大产量，预测值为6．074 g/L，对试验结果进行验证，得到胞外多糖的产量为5．905 g/L，与理论预测值基本一致．

［1］ 陈丽华，章克昌．8味中药对黑木耳发酵的影响［J］．食品与生物技术学报，2007，26(5):105-109．

［2］ 肖彩霞，王玉红，章克昌．黑木耳深层发酵工艺条件的研究［J］．生物技术，2004，114(15):70-71．

［3］ 史岳红，鲜乔，张拥军．不同品种黑木耳多糖含量差异的研究［J］．浙江食用菌，2009，17(5):15-17．

［4］ YUAN Z，HE P，CUI J．Hypoglycemic effect of watersoluble polysaccharide from from woody ear(Auricularia auricula-judae Quel．)in genetically diabetic KKAy mice［J］．Journal of nutritional science and vitaminology，1998，44(6):29-40

［5］ 韩春然，徐丽萍．黑木耳多糖的提取、纯化及降血脂作用的研究［J］．中国食品学报，2007，7(1):55-58．

［6］ J．Bohn，J．N．BeMiller．(l→3)-β-D-Glucans as biological respense modifiers:a review of structure-functional activity relations［J］．Carbohydrate Polymer，1995(28):3-14

［7］ 赵鑫．黑木耳分级多糖抗氧化活性及其相关生理功能研究［D］．哈尔滨:东北林业大学，2011

［8］ 张大为．以中药为基质的黑木耳多糖发酵工艺条件的研究［D］．贵阳:贵州大学，2008．

［9］ 唐青涛，陈福生．深层发酵黑木耳产胞外多糖的初步研究［J］．食品科学，2002，23(3):46-49．

［10］肖彩霞，章克昌．黑木耳胞外多糖深层发酵培养基组成的优化［J］．无锡轻工大学学报，2004，23(3):24-26．

［11］王国良，王志江，蔡景顺，等．黑木耳菌丝体发酵条件优化和发酵罐生产多糖的试验［J］．农业科技通讯，2009(1):42-59．

［12］穆文静，杜玲，扈瑞平，等．钝顶螺旋藻多糖Sevage法脱蛋白工艺的研究［J］．内蒙古石油化工，2011(10):1-4．