郑 亢，郜玉峰，潘高峰，殷宏娟，邹桂舟

IL-10R基因多态性与乙型肝炎病毒感染慢性化的相关性

郑 亢，郜玉峰，潘高峰，殷宏娟，邹桂舟

摘要目的 探讨IL-10R基因多态性与乙型肝炎病毒（HBV）感染后慢性化的相关性。方法 收集501例慢性HBV感染患者和301例急性自限性HBV感染患者外周血标本，两组患者的年龄、性别和地区来源均相互匹配。Snapshot方法检测IL-10R两个tag SNP（rs2228055、rs2256111）的基因型；χ2检验用于比较两组间基因型及等位基因频率分布。结果 IL-10R基因rs2228055、rs2256111多态等位基因和基因型频率在两组中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。IL-10R基因rs2228055位点G／G基因型频率（7.2%）明显低于急性自限性HBV感染患者（13.0%），差异有统计学意义（P ＜0.05）；GG基因型在HBV感染慢性化的风险是AG＋AA基因型的0.52倍（OR＝0.52，95%CI：0.32～0.84）。结论IL-10R rs2228055位点GG基因型在HBV感染后的慢性化中发挥保护作用。

关键词乙型肝炎病毒；单核苷酸多态性；IL-10R；易感性

2015-02-09接收

作者单位：安徽医科大学第二附属医院肝病科，合肥 230601

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染慢性化的原因非常复杂，除与HBV的变异、宿主的年龄、性别和免疫状态有密切关系外，遗传基因的多态性可能是导致HBV感染慢性化的另一个重要原因［1］。HBV感染后，机体对病毒的清除能力与机体的免疫功能密切相关，而病毒的清除与否决定着疾病的转归和预后［2］。白细胞介素10受体（interleukin-10 receptor，IL-10R）是重要免疫调节基因，通过其配体IL-10参与免疫负性调节，在免疫反应中发挥抗炎症的作用，从而维持机体内部免疫平衡［3-4］。最新的研究［5］显示IL-10R多态性与泰国人群HBV的易感性相关。由于不同人种存在遗传异质性，且目前尚未见IL-10R基因多态性与汉族慢性HBV感染相关性研究报道。该研究选取IL-10R基因为候选基因，探讨IL-10R基因rs2228055、rs2256111多态位点与HBV感染的遗传关联性。

1　材料与方法

1.1 病例资料 本研究收集了安徽医科大学第二附属医院肝病科门诊和住院的患者，无血缘关系的汉族人。慢性乙型肝炎患者501例，男284例，女217例，年龄19～65（45.8±14.9）岁，自愈性乙肝病毒感染者301例，其中男166例，女135例，年龄19 ～69（44.3±15.8）岁。患者的临床资料如表1所示。慢性乙型肝炎患者为有乙型肝炎病史或HBsAg阳性超过1年，血清HBsAg、HBeAg和HBV-DNA阳性者，1年内连续随访4次以上均显示谷丙转氨酶和谷草转氨酶均在正常范围内。自愈性乙肝病毒感染者为无乙肝疫苗接种史，HBsAg阴性，血清抗-HBs、血清抗-HBc阳性者，谷丙转氨酶和谷草转氨酶均在正常范围内。诊断符合国际慢性乙型肝炎诊断标准。该研究得到了安徽医科大学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 实验步骤 用抗凝的外周血标本2 ml提取基因组DNA，通过PCR扩增目的基因，PCR产物分离纯化，采用Snapshot延伸反应，然后进行测序、分析。IL-10R基因SNP位点的选择：根据HapMap数据中的信息，选择TagSNP中r2＞0.8，微等位基因MAF＞0.1，可能发挥功能的SNP作为候选的SNP位点。本研究选择了rs2228055、rs256111位点。

1.2.2 PCR引物的设计、扩增及基因分型 PCR扩增SNP位点所用是通过primer primer5.0设计，于上海生工科技生物公司合成，rs2228055上游引物：5′-TGTCCGTGTGCCATGAAATAAAA-3’，下游引物：5′-CTGAGAGCAGCCCAGCTGAC-3′；rs256111上游引物：5′-CCTCCTCAGCCCTCAAGTCTCA-3’，下游引物：5′-GGGAACCCCATACCGTGAAGTT-3′。PCR产物通过延伸引物进行基因分型，rs2228055位点延伸引物为CACTGCCTGGTGAGGGAGA，rs256111位点延伸引物为TTTTGGCCCAAGATGGCCCCCGC。

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0进行统计学分析，本研究两组患者的年龄等计量资料运用t检验，基因型及等位基因的比较及Hardy-Weinberg平衡检测均运用χ2检验或是Fisher确切概率法，基因型及等位基因的比较运用Bonferroni校正，单倍体由SHEsis统计软件分析。

2　结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检测 IL-10R基因rs2228055、rs256111多态位点的基因型及等位基因在两组患者中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。两组患者的年龄、性别差异均无统计学意义。

2.2 两组患者IL-10R基因多态位点基因型及等位基因的比较 IL-10R基因rs2228055、rs256111多态位点的基因型及等位基因频率情况见表1。rs2228055位点GG基因型在慢性HBV感染患者中显著低于自限性HBV感染患者（OR＝0.52，95% CI：0.32～0.84）。rs2228055位点GA基因型及rs2256111位点GA基因型在慢性HBV感染患者中有升高的趋势，但经Bonferroni校正后两组患者之间差异无统计学意义。两个多态位点的其他基因型与等位基因在两组患者中差异均无统计学意义。

表1　两组患者IL-10R的基因型及等位基因的频率比较［n（%）］

2.3 两组患者的单倍体比较 两个多态位点通过SHEsis软件进行单倍体构建，两组患者单倍体类型的比较见表2。结果显示，两个多态位点构成的单倍体在两组之间差异均无统计学意义。

3　讨论

HBV感染人体后，由于机体对病毒的清除能力不同，会导致不同的转归。若免疫功能低下或是免疫缺陷，不能彻底地清除病毒，病毒潜伏于肝脏，经过长期的免疫耐受期的沉寂后开始发病，即导致慢性乙型肝炎［1］。在我国，慢性乙型肝炎的患者人数众多，发病率较高，且目前尚无特效的治疗方式，主要是抗病毒及对症治疗。慢性乙型肝炎的发病机制复杂，免疫和遗传因素参与其发病。多种免疫相关基因多态与HBV的遗传易感性相关，这些基因在HBV感染的预后过程中发挥着重要作用。IL-10、GTP结合核蛋白等多种基因的多态性与慢性乙型肝炎显著相关，而已发现的基因只能解释慢性乙型肝炎的易感性［3，6］。基于遗传、免疫因素的共同作用，因此免疫相关的基因与慢性HBV感染的遗传易感性研究是当前研究的热点。本研究结果表明IL-10R基因rs2228055位点GG基因型与慢性乙型肝炎显著相关；而rs2228055位点GA，rs2256111位点GA和AA基因型在慢性HBV感染中有升高趋势，经校正后与疾病无相关性；单倍体未发现与该病存在相关性。研究［6-9］表明，rs2228055位点与慢性丙型肝炎和早期溃疡性结肠炎显著相关；而rs2256111位点在韩国人群中与高血压及前列腺肥大相关。这些不同的结果可能是由于不同的种族在遗传上具有异质性所致，不同疾病存在不同的遗传易感性位点。

表2　慢性乙型肝炎患者和自限性肝炎患者的IL-10R单倍体频率比较（n）

IL-10是重要的抗炎因子，主要由调节T细胞、巨噬细胞和Th2细胞分泌的，IL-10发挥抗炎症及免疫调节作用是通过与其配体IL-10R结合［2，4］。在HBV感染的患者中，IL-10的表达水平明显增加。IL-10及IL-10R的基因多态性是炎症性疾病研究的热点，这些基因某些单核苷酸的多态性可能影响基因的表达或是功能，从而调控免疫反应。本研究显示，IL-10R基因rs2228055多态位点GG基因型在慢性乙型肝炎患者中显著降低，在该病中发挥保护作用。根据该多态位点的位于IL-10R基因的外显子区段，IL-10R基因的rs2228055A／G位点会导致氨基酸合成的改变：异亮氨酸和缬氨酸。当此位点等位基因为A碱基时，该位点编码的氨基酸为异亮氨

酸；而当该位点等位基因为G碱基时，编码的氨基酸为缬氨酸。由此可知，此位点的多态性导致了氨基酸的改变，进而影响IL-10R基因的表达或功能。在此基础上，可推测IL-10R基因的rs2228055A／G位点对疾病的影响：可能因为该多态位点通过改变编码的氨基酸影响IL-10R的功能及表达水平，进而引起免疫平衡打破，机体清除HBV能力的改变，从而影响疾病的发生。

同其他的病例对照研究一样，本文的不足之处主要有以下几个方面［10］：首先，在于患者仅来自于汉族人群，需要其他多种族、大样本的标本验证。其次，没有对本研究显示的与HBV感染慢性化相关的多态位点rs2228055进行功能研究。

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Association between IL-10R gene polymorphisms and spontaneous clearance of hepatitis B virus infection

Zheng Kang，Gao Yufeng，Pan Gaofeng，et al
（Dept of Infectious Diseases，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032）

AbstractObjective To examine whether IL-10R polymorphisms were associated with susceptibility to chronic hepatitis B virus（HBV）infection in a Chinese Han population.Methods A total of 501 chronic HBV-infected patients as cases and 301 age-，sex-，and ethnically matched self-limiting HBV-infected individuals as controls were recruited in this study.Two tag SNPs（rs2228055 and rs2256111 of IL-10R）were genotyped in all subjects by using Snapshot method.The frequencies of alleles and genotypes between the two groups were analyzed by χ2analysis.Results All genotype and allele distributions in patients with C-HBV and patients with SL-HBV were in Hardy-Weinberg equilibrium.The frequency of the rs2228055 GG genotype（7.2%）was significantly decreased in patients with C-HBV as compared to SL-HBV patients（13.0%）.In patients with chronic HBV infection，the risk of GG genotype in patients is 0.52 times of that of the AG，AA genotypes patients（OR＝0.52，95%CI：0.32～0.84）.Conclusion In this study，the results suggest that the rs2228055 GG genotype of IL-10R is associated with the susceptibility to chronic HBV infection in the Chinese Han population.

Key wordshepatitis B virus；single polymorphism；interleukin-10 recepter；gene susceptibility

作者简介：郑 亢，女，硕士研究生；邹桂舟，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：ayzouguizhou＠sina.com

基金项目：国家自然科学基金（编号：81273142）

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）05-0632-03

中图分类号R 512.6＋3