梁小凤，朱雯婷，饶进军，王文雅

6-羟基-1-氢-吲唑保护MPP＋诱导凋亡的SH-SY5Y细胞的机制

梁小凤1，朱雯婷2，饶进军1，王文雅1

摘要目的 研究6-羟基-1-氢-吲唑对1-甲基-4-苯基-吡啶离子（MPP＋）诱导凋亡的SH-SY5Y细胞的保护作用机制。方法 体外培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，以200 μmol／L MPP＋诱导SH-SY5Y细胞凋亡建立体外帕金森病细胞模型。Western blot法分别检测200 μmol／L MPP＋和200 μmol／L MPP＋联合0.1 μmol／L 6-羟基-1-氢-吲唑作用后SHSY5Y细胞内糖原合酶激酶3β（GSK-3β）、周期依赖性蛋白激酶5（CDK5）以及凋亡蛋白酶3（caspase-3）的活性。结果 200 μmol／L MPP＋作用SH-SY5Y细胞8 h，GSK-3β、CDK5与caspase-3活性升高。200 μmol／L MPP＋联合0.1 μmol／L 6-羟基-1-氢-吲唑作用SH-SY5Y细胞8 h，GSK-3β、CDK5与caspase-3的活性降低。结论 6-羟基-1-氢-吲唑对MPP＋诱导凋亡的SH-SY5Y细胞的保护机制可能是抑制GSK-3β、CDK5和caspase-3的活性。

关键词6-羟基-1-氢-吲唑；SH-SY5Y细胞；MPP＋；糖原合酶激酶3β；周期依赖性蛋白激酶5；凋亡蛋白酶3

2015-01-20接收

作者单位：1南方医科大学药学院临床药理研究所，广州 510515

2江西省新余市人民医院药剂科，新余 338000

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是位居第二的神经退行性疾病［1］。PD病因未明，主要病理改变是多巴胺能神经元丢失、Lewy-body蛋白沉淀、tau过度磷酸化等［2］。现今主流的治疗方案是补充左旋多巴，但左旋多巴不能减缓PD的病程，长期使用疗效不佳［3］，这迫使人们寻找新的治疗方案。前期工作表明1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP＋）诱导SH-SY5Y细胞凋亡建立的体外PD细胞模型中，6-羟基-1-氢-吲唑可保护多巴胺能神经元和抑制tau磷酸化，但作用的具体信号通路尚不清楚。PD普遍存在tau过度磷酸化［4］，体内磷酸化tau的主要激酶有糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）和周期依赖性蛋白激酶5（cyclin dependent kinase 5，CDK5）［5］。GSK-3β的活性主要通过216位点酪氨酸（Tyr216）和9位点丝氨酸（Ser9）的磷酸化水平调节，两位点磷酸化可分别使GSK-3β失活和活化［6］。p25是由p35降解而得，催化CDK5活性的能力比p35强很多，两者在体内处于动态平衡，统计p35／p25可检测CDK5的活性变化［7］。caspase-3是体内调节神经元凋亡的关键蛋白酶［8］，该研究还将检测该酶的活性变化来探讨6-羟基-1-氢-吲唑抑制SH-SY5Y细胞凋亡的可能通路。

1　材料与方法

1.1 细胞 人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y由中山大学中山医学院药理教研室惠赠。

1.2 药品 高糖DMEM培养基（美国Hyclone公司）；6-羟基-1-氢-吲唑、MPP＋（美国Sigma公司）。

1.3 抗体 特异性磷酸化p-GSK-3β（Tyr216）的小鼠多克隆抗体（美国BD公司）；特异性磷酸化p-GSK-3β（Ser9）、CDK5亚基p35／p25蛋白、caspase-3的兔多克隆抗体（美国CST公司）。

1.4 仪器 CEA-800型CO2组织培养箱（美国Forma Scientific公司）；BJ-2CD型超净工作台（上海博迅公司）；5810R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；iMark型吸收光酶标仪、PowerPac 300型电泳仪、PowerPac 200型半干转膜仪（美国BIO-RAD公司）。

1.5 方法

1.5.1 SH-SY5Y细胞培养 SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。消化传代接种在24孔细胞培养板，待细胞贴壁。

1.5.2 MPP＋处理SH-SY5Y细胞 MPP＋用无血清的DMEM培养基配成100×1 mmol／L储备液，加到培养基中，使终浓度为200 μmol／L，在2、4、8、16和24 h时间点，收集正常对照组、各时间点MPP＋组细胞，通过Western blot法检测MPP＋对SH-SY5Y细胞内p-GSK-3β（Tyr216）、p-GSK-3β（Ser9）和p35蛋白表达水平影响的时效。

1.5.3 6-羟基-1-氢-吲唑联合MPP＋处理SH-SY5Y

细胞 在细胞实验中，6-羟基-1-氢-吲唑用DMSO溶解，配成100 μmol／L的储备液，直接加到6-羟基-1-氢-吲唑给药组培养基中，使终浓度为0.1 μmol／L。正常对照组、MPP＋组加入等体积DMSO。2 h后，各组加入MPP＋，培养8 h后，收集各组细胞，使用Western blot法检测各组细胞p-GSK-3β（Tyr216）、p-GSK-3β（Ser9）、p35、p25和caspase-3的表达水平，用以探讨6-羟基-1-氢-吲唑保护MPP＋诱导凋亡的SH-SY5Y细胞的可能作用机制。

1.5.4 Western blot法检测 弃去24孔板内的培养液，用预冷的PBS漂洗细胞2次，置于冰上，每孔加入150 μl细胞裂解液（SDS 2 g、Tris碱0.757 1 g、溴酚蓝0.01 g、DTT 0.771 g、去离子水90 ml、甘油10 ml）裂解20 min，超声，4℃、1 400 r／min离心10 min，沸水煮5 min，冷却。BCA法进行蛋白定量后，加入5×上样缓冲液，上样，以10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，半干电转移法转移至PVDF膜，室温下用封闭液封闭1 h后加入用封闭液稀释的一抗4℃震荡过夜，第2天取出，室温孵育二抗2 h，ECL显色液两种显色底物1∶1等体积混合，暗室反应1 min，压胶片曝光，βactin作为内参照。扫描胶片，运用ger-pro analyzer对免疫印迹条带进行半定量分析，目的蛋白条带的密度与β-actin相比，用相对光密度（relative optical density，ROD）来表示。

1.6 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行分析，实验结果以±s表示，采用One-way ANOVA分析。

2　结果

2.1 MPP＋诱导SH-SY5Y细胞内GSK-3β活性增高 Western blot法结果显示，200 μmol／L MPP＋处理SH-SY5Y细胞8 h后，GSK-3β Tyr216位点的磷酸化水平明显比正常对照组高（P＜0.01）；GSK-3β Ser9位点的磷酸化水平则在4 h后开始显著降低，8 h达到最低水平（P＜0.01）。200 μmol／L MPP＋在8 h可使SH-SY5Y细胞的GSK-3β达到最高活性。见图1。

2.2 MPP＋诱导SH-SY5Y细胞内CDK5的活性增高 Western blot法结果显示，200 μmol／L MPP＋处理SH-SY5Y细胞2、4、8、16和24 h后，p35表达明显比正常对照组低（P＜0.01）。见图2。

2.3 6-羟基-1-氢-吲唑对MPP＋诱导增高的GSK-3β活性具有抑制作用 因为MPP＋作用8 h对SHSY5Y细胞内GSK-3β和CDK5的活性综合影响最大，故选择在此时间点探讨6-羟基-1-氢-吲唑抑制MPP＋诱导SH-SY5Y细胞凋亡的作用机制。Western blot法结果显示，200 μmol／L MPP＋处理SHSY5Y细胞8 h后，GSK-3β（Ser9）磷酸化水平明显比正常对照组低，GSK-3β Tyr216位点的磷酸化水平明显比正常对照组高（P＜0.01）。200 μmol／L MPP＋联合0.1 μmol／L 6-羟基-1-氢-吲唑处理SHSY5Y细胞8 h后，GSK-3β（Ser9）磷酸化水平明显比200 μmol／L MPP＋处理组高，GSK-3β Tyr216位点的磷酸化水平明显比200 μmol／L MPP＋处理组低（P＜0.01）。见图3。

2.4 6-羟基-1-氢-吲唑对MPP＋诱导增高的CDK5

活性具有抑制作用 Western blot法结果显示，200 μmol／L MPP＋处理SH-SY5Y细胞8 h后，p35／p25的比值明显比正常对照组低（P＜0.01）。200 μmol／L MPP＋联合0.1 μmol／L 6-羟基-1-氢-吲唑处理SH-SY5Y细胞8 h后，p35／p25的比值明显比200 μmol／L MPP＋处理组高（P＜0.01）。见图4。

2.5 6-羟基-1-氢-吲唑可抑制MPP＋诱导SHSY5Y细胞内凋亡蛋白酶caspase-3的增高 Western blot法结果显示，200 μmol／L MPP＋处理SHSY5Y细胞8 h后，caspase-3的表达明显比正常对照组高（P＜0.01）；200 μmol／L MPP＋联合0.1 μmol／L 6-羟基-1-氢-吲唑处理SH-SY5Y细胞8 h后，caspase-3的表达明显比200 μmol／L MPP＋处理组低（P＜0.01）。见图5。

3　讨论

MPP＋诱导SH-SY5Y细胞凋亡是现今广泛用于建立体外研究PD病理机制和筛选新药的PD细胞模型的方法［9］。虽然PD病因未明，但已有研究［5］表明PD患者体内GSK-3β和CDK5的活性增高，与病因密切相关。GSK-3β是PD中引起神经元凋亡的关键性激酶，过度激活可致tau过磷酸化。而tau过磷酸化可导致微管稳定性及其有丝分裂功能和维持神经元生长发育功能异常，由此介导了多巴胺能神经元凋亡［10］。此前的研究［11］证明，Indirubin-3’-oxime和AR-A014418可通过抑制GSK-3β的活性来降低tau过磷酸化，并且由此抑制MPP＋诱导的多巴胺能神经元凋亡。在本研究中，通过Western blot检测到MPP＋可提高GSK-3β Tyr216的磷酸化水平，

同时抑制Ser9磷酸化水平，以致GSK-3β过度激活，但是6-羟基-1-氢-吲唑降低GSK-3β Tyr216的磷酸化水平的同时也提高了Ser9的磷酸化水平，由此可知6-羟基-1-氢-吲唑可降低MPP＋诱发升高的GSK-3β活性，可能由此抑制了tau磷酸化，减少多巴胺能神经元的凋亡。实验中观察到6-羟基-1-氢-吲唑还可以降低MPP＋诱发升高的p35／p25比值，抑制CDK5的活性。已有研究［7］证明，CDK5在PD中是异常活跃的，可引起tau过度磷酸化和小神经胶质细胞过度增生。甚至，已发现过表达CDK5亚基p25的小鼠可致神经退行性疾病和认知障碍，并且其机制为CDK5过度激活导致tau过度磷酸化［12］。由此可知，6-羟基-1-氢-吲唑抑制CDK5的活性，可能进一步降低tau蛋白过磷酸化，保护多巴胺能神经元。

目前，已有研究［13］表明神经退行性疾病普遍存在caspase-3过度激活，从而诱发神经元凋亡，其具体表现为DNA断裂、线粒体损伤、神经元退化及其轴突病变，若抑制该酶的活性，依赖此凋亡酶的细胞凋亡途径将无法正常进行。MPP＋可引起caspase-3的过度激活，促进SH-SY5Y细胞死亡［14］。但是给予6-羟基-1-氢-吲唑预处理后，SH-SY5Y细胞内caspase-3表达量显著下降，因此抑制caspase-3的活性是6-羟基-1-氢-吲唑保护多巴胺能神经元的另一机制。

综上所述，6-羟基-1-氢-吲唑保护多巴胺能神经元的机制可能是同时抑制GSK-3β和CDK5活性。此外，6-羟基-1-氢-吲唑还可抑制凋亡蛋白酶caspase-3的活性，这是该化合物保护多巴胺能神经元的另一可能机制。

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The mechanism of 6-hydroxy-1H-indazole’s neuroprotection from MPP＋-induced apoptosis of SH-SY5Y cells

Liang Xiaofeng1，Zhu Wenting2，Rao Jinjun1，et al
（1Institute of Clinical Pharmacology of School of Pharmaceutical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510515；2Dept of Pharmacy，Xinyu People’s Hospital in Jiangxi Province，Xinyu 338000）

AbstractObjective To investigate the mechanism of 6-hydroxy-1H-indazole’s neuroprotection from 1-methyl-4-phenylpyridinium（MPP＋）-induced apoptosis of SH-SY5Y cells.Methods The model of Parkinson’s disease in

vitro was built through SH-SY5Y cells’s exposure to 200 μmol／L MPP＋.Cultured SH-SY5Y cells were respectively exposed to 200 μmol／L MPP＋and 200 μmol／L MPP＋combined 0.1 μmol／L 6-hydroxy-1H-indazole，then the variations of activity of glycogen synthase kinase-3β（GSK-3β），cyclin dependent kinase 5（CDK5）and caspase-3 were determined by Western blot.Results 200 μmol／L MPP＋increased the activity of GSK-3β，CDK5 and caspase-3 in SH-SY5Y cells.200 μmol／L MPP＋combined 0.1 μmol／L 6-hydroxy-1H-indazole inhibited the activity of GSK-3β，CDK5 and caspase-3 in SH-SY5Y cells.Conclusion 6-hydroxy-1H-indazole decreases the activity of GSK-3β，CDK5 and caspase-3 to protect SH-SY5Y cells from MPP＋-induced toxicity.

Key words6-hydroxy-1H-indazole；SH-SY5Y cells；MPP＋；GSK-3β；CDK5；caspase-3

作者简介：梁小凤，女，硕士研究生；王文雅，女，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：wangwy ＠fimmu.com

基金项目：国家自然科学基金重点项目（编号：81030024）；广东省自然科学基金（编号：S2012010009368）；广东省教育部产学研结合项目（编号：2012B091100465）

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）05-0585-05

中图分类号R 962；R 742.5