李颖 张继磊 程盼盼 张颢

·基础研究·

As2O3介导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞凋亡的JNK磷酸化机制研究

李颖 张继磊 程盼盼 张颢

目的探讨JNK磷酸化在As2O3诱导的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞凋亡过程中的参与机制。方法人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株LY1随机分为5组:对照组、三氧化二砷低剂量、中剂量、高剂量组及JNK阻断剂SP600125组。对照组和三氧化二砷组细胞给予DMSO或三氧化二砷(1 Μm，5 μM和25 μM)孵育20 h。SP600125组在三氧化二砷(25 μM)孵育的同时加入SP600125(10 μM)孵育。CCK-8测定各组LY1细胞活力情况，qPCR和Western Blot分析各组细胞中细胞凋亡蛋白Bax、Bcl2、Caspase9及JNK和p-JNK蛋白的表达变化情况。结果人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株LY1随着三氧化二砷作用浓度升高而活力逐渐降低，且各组之间具有显著的统计学差异性(P＜0．01)。qPCR和Western Blot结果显示三氧化二砷各组细胞凋亡蛋白Bax和Caspase9表达升高，而Bcl2表达降低。同时，三氧化二砷组中p-JNK1/2表达明显增高。而SP600125组上述异常均得到部分恢复。结论JNK磷酸化过程参与了三氧化二砷诱导的弥漫大B细胞淋巴瘤的细胞凋亡过程。

三氧化二砷;弥漫大B细胞淋巴瘤;LY1;细胞凋亡

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:1107～1111)

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是临床上常见的血液恶性肿瘤［1］，而弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是一组在临床特征、细胞遗传学及免疫表型方面存在较大异质性的恶性肿瘤［2］。三氧化二砷主要通过诱导肿瘤细胞的凋亡来实现其抗肿瘤作用［3］。Bax/Bcl2是一组与细胞凋亡相关的蛋白。同时，细胞凋亡还与Caspase家族相关。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)介导了多种肿瘤细胞的信号交流过程，与细胞的生长、分化、增殖和凋亡等相关［4］。本文分析细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、Capsase3/9及JNK通路在As2O3诱导人DLBCL细胞株LY1细胞凋亡中的参

与机制，为临床治疗及相关新药开发提供参考。

1 材料与方法

1．1 试剂及仪器

荧光定量PCR仪(ABI 7700)，ABI，美国;冷冻高速离心机:Eppendorf，德国;电泳仪转印槽及PVDF膜，Bio-Rad，美国;CK40显微镜，奥林巴斯，日本。

DAB显色试剂盒购自北京中山生物有限公司;高纯总RNA提取试剂盒、TRIzol、氯仿购自BioTek公司，逆转录酶M-MLV第一链合成系统购自Invitrogen，βactin及目的基因、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ购自TaKaRa公司。

1．2 细胞株培养

人弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞株LY1由本单位保存。将LY1细胞株于IMDM培养基(含10%胎牛血清)中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中进行培养。取对数生长期的LY1细胞进行实验。

1．3 细胞分组及药物处理

取对数生长期的LY1细胞0．2 ml(1×105/ml)接种至96孔细胞培养板中，As2O3组分别加入As2O3溶液控制其最终浓度为1 Μm、5 μM和25 μM。SP600125组控制As2O3和SP600125的浓度分别为25 μM和10 μM。对照组加入等量的DMSO孵育20 h。

1．4 CCK-8测定细胞活力

向1．3处理后的细胞培养孔中加入10 μL的CCK8(避光)，震荡混匀并放入培养箱中继续培养4 h，取出细胞培养板于450 nm处测定吸光度。细胞活力(%)=(A处理-A空白)/(A0处理-A空白)× 100。A处理:含细胞、As2O3和CCK8培养孔吸光度; A空白:含培养基和CCK8培养孔的吸光度;A0处理:含细胞和CCK8培养孔的吸光度。

1．5 qPCRmRNA提取及逆转录

Real-Time PCR反应条件:95℃热启动10 min;94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，72℃收集荧光，共37个循环。引物序列见表1。

表1 荧光实时定量PCR引物序列

1．6 Western Blot

LY1细胞在冰水浴中用裂解液充分裂解，采用考马斯亮蓝法蛋白定量后以等量蛋白进行SDS-PAGE和半干法转膜。转至PVDF膜上后5%脱脂牛奶室温条件下封闭2 h。然后与一抗4℃温孵12 h，PBS漂洗3次后与二抗室温反应1 h。PVDF膜用PBS漂洗后用ECL混合液显色、曝光、显影、定影，用凝胶成像分析系统测定光密度，以β-actin作为参照，进行蛋白表达的定量分析。

1．7 统计学处理

应用SPSS 13．0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 As2O3抑制DLBCL细胞株LY1的增殖

结果发现:LY1细胞株的细胞活力随As2O3浓度的增高而降低，且与对照组相比，具有显著统计学差异性(P＜0．01)。而JNK抑制剂SP600125组细胞活力明显恢复，与As2O3高剂量组细胞活力比较具有显著的统计学差异性(P＜0．01)，见图1。

图1 As2O3及其抑制剂诱导的LY1细胞活力变化

2．2 qPCR检测细胞凋亡蛋白的表达

qPCR检测发现，与对照组相比，As2O3组Bax的表达水平均明显上调，且具有显著统计学差异性(P＜0．01)，而抑制凋亡蛋白Bcl2的表达水平明显降低，也与对照组比较有显著统计学差异性(P＜0．01)。SP600125组的上述2种mRNA的异常表达部分恢复，见图2。

图2 As2O3及其抑制剂诱导LY1细胞细胞凋亡因子Bax、Bcl2 mRNA表达的变化

2．3 Bax及Bcl2蛋白异常表达

免疫印迹显示，As2O3组促细胞凋亡蛋白Bax和抑制细胞凋亡蛋白Bcl2的表达变化与mRNA的变化基本一致:与对照组相比，均具有显著差异(P＜0．01)，而JNK抑制剂SP600125可以显著恢复上述靶点的异常表达(P＜0．01)，见图3。

图3 As2O3及其抑制剂诱导LY1细胞凋亡蛋白Bax和Bcl2表达的变化

2．4 As2O3诱导p-JNK蛋白上调异常表达

免疫印迹结果显示，As2O3组p-JNK表达水平均较对照组明显升高(P＜0．01)，而总JNK的表达量在各组间无显著差异性(P＞0．05)，且JNK抑制剂SP600125组比高剂量As2O3组对p-JNK表达的调控作用更明显，且具有显著的统计学差异性(P＜0．01)，见图4。

图4 As2O3及PD600125诱导的LY1细胞JNK及p-JNK表达的变化

2．5 Caspase9蛋白上调表达

免疫印迹结果显示，As2O3组促细胞凋亡蛋白Caspase9的表达水平均较对照组明显增高(P＜0．01)，且JNK抑制剂SP600125组比高剂量As2O3组的Caspase9的调控效果更明显，且具有显著的统计学差异性(P＜0．01)，见图5。

图5 As2O3及其抑制剂诱导的LY1细胞凋亡蛋白Caspase 9表达的变化

3 讨论

非霍奇金淋巴瘤是恶性肿瘤中除霍奇金淋巴瘤以外的肿瘤，主要发生于淋巴结及结外淋巴组织，主要与免疫功能异常密切相关，而弥漫大B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤的主要种类。本研究通过As2O3与人弥漫大B细胞淋巴瘤LY1细胞株共孵育发现，As2O3可以明显减弱LY1细胞的细胞活力，且可以明显增高细胞凋亡蛋白Bax及Caspase9的表达，同时降低抑制凋亡蛋白Bcl2的表达，即As2O3引起了LY1细胞的凋亡过程。同时，As2O3各组中JUN通路关键蛋白p-JNK1/2表达明显增高，表明JNK通路的激活也参与了As2O3诱导的LY1细胞凋亡过程。

细胞凋亡是细胞的1种主动的程序化的细胞死亡过程，主要有外源性和内源性两种信号通路。细胞凋亡的内源性通路主要与线粒体功能的异常相关:线粒

体除了参与细胞凋亡过程外，还是主要的能量供应细胞器［5］。研究证实，Bcl2家族是定位于线粒体上的与细胞凋亡相关的蛋白。与正常对照组细胞相比，As2O3引起LY1细胞抑制凋亡因子Bcl2蛋白表达的下调，并同时诱导了促细胞凋亡因子Bax蛋白表达的增大，提示As2O3诱导的LY1细胞凋亡主要通过内源性通路，促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl2参与了该过程。Bax/Bcl2是调控细胞凋亡的最重要的一组调控蛋白。Bcl2蛋白通过调节线粒体膜通道孔的开关、抑制细胞色素C和凋亡诱导因子表达来抑制细胞的凋亡过程。而Bax通常以无活性的状态存在于细胞质中。当细胞受到凋亡信号时，Bax发生构象的变化，转移至线粒体膜上，形成同源性二聚体状态，干扰线粒体膜的完整性，诱导细胞因子的释放而促进细胞发生凋亡过程。

Capase细胞凋亡家族也与Bax/Bcl2相关:Bax蛋白增多或Bcl2蛋白降低均可诱导Caspase家族蛋白的激活，从而发挥促进细胞凋亡的作用［6］。本研究中As2O3诱导的LY1细胞凋亡过程中Capase3的mRNA及蛋白和Caspase9的蛋白表达均增高，提示Capase家族也参与了细胞凋亡的病理过程。这与本文中发现的Bax表达上调和Bcl2表达下调结论一致。

JNK通路是MAPK通路的重要组分，介导了细胞的增殖、分化、生长和凋亡的过程。本研究中As2O3可以引起弥漫大B细胞淋巴瘤中p-JUN蛋白表达的明显增高，而总JNK蛋白表达量在各组之间无显著的统计学差异性，即As2O3引起LY1细胞中JUN通路被激活。在其他类的肿瘤组织中也发现As2O3或其他砷类化合物引起的JNK通路的激活。因此，我们推断，As2O3引起的细胞凋亡过程是由Bax/Bcl2及Caspase家族引起的，而JNK通路在此过程中起到了关键的作用。Caspase蛋白在细胞中主要以酶原的形式存在，而凋亡信号诱导了JUK通路的激活，并进一步促进Caspase酶原的降解，形成了活化形式的Caspase9，并诱导了LY细胞的凋亡过程。

因此，三氧化二砷可以明显降低弥漫大B淋巴瘤的细胞活力，同时JNK磷酸化过程参与了三氧化二砷诱导的弥漫大B细胞淋巴瘤的细胞凋亡过程。

［1］贾存东，赵兵，古力克孜·吾守尔，等．大剂量BEAC方案联合自体外周血干细胞移植治疗非霍奇金淋巴瘤临床分析〔J〕．中华肿瘤防治杂志，2013，20(21):1665-1667，1671．

［2］陆锦标，季菊玲，李小秋，等．弥漫大B细胞性淋巴瘤中mTOR信号通路的激活〔J〕．肿瘤防治研究，2012，17 (11):1385-1387．

［3］高克非，冯艳玲，黄永文，等．三氧化二砷联合塞来昔布对卵巢癌细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用〔J〕．肿瘤，2014，9(7):602-608．

［4］傅应亚，韩晓黎，黎友伦．抑制JNK信号通路下调A549中LRP表达可增强顺铂化疗敏感性〔J〕．中国肿瘤临床，2013，21(24):1518-1522．

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The Involvement of JNK Phosphorylation in Diffuse Large-B Cell Lymphoma Apoptosis Mediated by As2O3

LI Ying，ZHANG Jilei，CHENG Panpan，et al．Affiliated Hospital of Jining Medical College，Jining，272000

ObjectiveTo explore the participation of JNK phosphorylation in the apoptosis of diffuse large-B cell lymphoma induced by As2O3．MethodsHuman DLBCL cell line LY1 was divided into the control group，As2O3group and JNK inhibitor SP600125 group．And As2O3group were divided into the low dose，middle dose and high dose group．The control group and As2O3group were incubated with DMSO or As2O3(1 Μm，5 μM and 25 μM)for 20 h．SP600125 cells were incubated with As2O3(25 μM)and SP600125(10 μM)．The cellular viability was calculated by CCK-8 and apoptotic proteins Bax、Bcl2、Caspase9，JNK and p-JNK were detected by qPCR and Western Blot．ResultsThe viability of LY1 decreased with the increase of As2O3concentration，there had significant difference(P＜0．01)．qPCR and Western Blot showed that apoptotic proteins Bax and Caspase9 increased in As2O3group while Bcl2 decreased．p-JNK in As2O3group increased dramatically．SP600125 can alleviate the aforementioned parameters greatly．ConclusionThe apoptosis of LY1 cell line induced by As2O3is regulated by apoptotic proteins that mediated by JNK phosphorylation．

As2O3;Diffuse large-B cell lymphoma;LY1;Apoptosis

10．3969/j．issn．1001-5930．2015．08．001

R733．4

A

1001-5930(2015)08-1107-05

2014-11-05

2015-07-01)

(编辑:吴小红)

山东省科技厅项目(2012YD18066);济宁市科技局项目(2012AA2Z3354)

272000山东济宁医学院附属医院血液科