鲁玉荣，袁莉刚，王勋，张辉，甘利鹏，黄宁，闫振龙，陈国娟，张吉文

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州　730070)



藏绵羊羔羊睾丸leydig细胞增龄性变化特征

鲁玉荣，袁莉刚，王勋，张辉，甘利鹏，黄宁，闫振龙，陈国娟，张吉文

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州730070)

摘要：为了比较分析不同月龄藏绵羊羔羊睾丸leydig细胞发育特征，探索其发育特征与生精功能的关系.应用组织化学方法及电子显微镜技术，研究了1～6月龄羔羊睾丸leydig细胞增龄性变化特征.光镜观察结果表明： leydig细胞及其周围间质组织结构随月龄增龄性变化明显.1，2月龄羔羊睾丸间质内毛细血管分布较少，管壁内皮细胞较圆，发育不完善，周围有散在的纺锤形或星形的幼稚成纤维细胞，结缔组织分布较少；3，4月龄羔羊睾丸间质内血管内皮细胞发育完善,巨噬细胞位于间质血管周围,细胞较大,形态不规则,结缔组织有所增加；5，6月龄羔羊睾丸间质内毛细血管数量增多，管壁内皮细胞包围成形，成纤维细胞呈长索状，轮廓清楚，核仁大而明显，结缔组织明显增加.电镜下观察结果表明，3月龄之前睾丸leydig细胞以幼稚型为主，核较圆，异染色质较多，胞体近卵圆形；3月龄的羔羊睾丸leydig细胞体积明显增大，可见少量粗面内质网，胞浆内有少量分泌性颗粒出现.4月龄及以后的羔羊leydig细胞体积大，胞核多不规则，核仁明显，胞浆内空泡及分泌性颗粒明显增多；间质成纤维细胞呈长索状，血管壁内皮细胞包围成形.因此，3月龄之前，藏绵羊羔羊leydig细胞处于胚胎型向成熟型过渡时期；4月龄以后逐渐发育成熟，为leydig细胞的局部分泌调节提供结构支持，对生精小管的进一步发育以及后期精子发生具有重要意义.

关键词：藏绵羊羔羊；睾丸；leydig细胞；睾丸间质

第一作者：鲁玉荣(1990-)，女，研究方向为动物发育生物学.E-mail:1308065453@qq.com

1850年，Leydig首次描述了光镜下睾丸leydig细胞的形态，此后许多学者从功能、发育、分化等不同方面，对leydig细胞做了大量研究[1].睾丸leydig细胞不同于生殖细胞和sertoli细胞，其数量增加不是靠自身的有丝分裂，而是由间充质细胞分化而成，这种分化能力从胚胎时即存在，参与leydig细胞的更新[2].Manicin等[1]研究表明，人类leydig细胞的发育可以分为胚胎期、哺乳期、少年期、青春期及成年期,指出在胚胎期间充质细胞分化为幼稚型leydig细胞,然后再分化为成熟型,但是大部分呈退化型.据Mori报道[3]，睾丸leydig细胞占睾丸体积的2.7%，睾酮的产生主要是来自leydig细胞，其可促进精子发生和雄性生殖器官发育，维持第二性征和性功能.迄今为止，关于人及实验动物大鼠、小鼠等leydig细胞形态及生物学功能的研究较多，但是对长期生活在高海拔地区土著动物leydig细胞的研究较少.朱峻峰等[4]研究了不同发育阶段牦牛睾丸leydig细胞的发育特点，认为在1岁时牦牛leydig细胞数量增加明显，但是对藏绵羊睾丸leydig细胞结构特征尚未见报道.本研究拟通过组织化学观察结合透射电镜技术，认识藏绵羊羔羊睾丸leydig细胞发育特点，比较性成熟前不同月龄藏绵羊睾丸leydig细胞发育特征，分析其组织形态变化规律,为高原哺乳动物生殖生理研究提供参考.

1材料与方法

1.1试验材料

在青海省西宁市大通县牧区,收集采取1～6月龄藏绵羊睾丸各8～10对，取样固定.

1.2组织样品制备和观察

样品切成1 cm×1 cm×0.6 cm组织块，福尔马林液固定，常规石蜡包埋，切片厚5 μm.Masson三色染色(亮绿)，胶原纤维呈现蓝绿色，细胞核呈现灰黑或灰蓝色，红细胞呈现红色.Delafield 氏苏木素-伊红染色法进行常规结构观察.

1.3透射电镜观察

电镜制片样品切成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm组织块，2%多聚甲醛-2.5%戊二醛溶液固定，丙酮乙醇梯度脱水，Epon812包埋，LKB8800型超薄切片机切片，醋酸铀、硝酸铅双重染色，日本JEM-100CX透射电子显微镜观察照相.

1.4显微结构观察

通过Olympus DP71 显微照相系统，采用NIKON ECLIPSE 80i 型显微摄像系统观察、照相.

1.5数据统计

每个组织切片观察随机选取10个视野，用IPP图像分析软件测量leydig细胞数量及其面积.利用SPSS16.0软件对统计数据进行单因素方差分析,用LSD 法对平均数进行多重比较.

2结果与分析

2.1睾丸间质显微结构特征

光镜下，1月龄羔羊睾丸leydig细胞体积较小，间质内血管和结缔组织较少(图1-A)；2月龄羔羊睾丸leydig细胞体积有所增大，血管内皮细胞形成较为明显管腔(图1-B)；3月龄羔羊leydig细胞体积明显增大，呈圆形或多边形，胞核大而圆，有分泌性颗粒出现(图1-C)；4月龄羔羊睾丸生精小管排列紧密，leydig细胞数量及其内部分泌性颗粒增多(图1-D)；5月龄羔羊睾丸生精小管排列密集，leydig细胞数量明显增多，周围出现巨噬细胞，生精小管间血管分布明显(图1-E)；6月龄羔羊睾丸相邻3～4个生精小管间质区形成明显三角形，leydig细胞数量增多，成群密集分布(图1-F).

藏绵羊羔羊睾丸间质组织随月龄增加结构变化明显.1，2月龄羔羊睾丸间质内毛细血管分布较少，管壁内皮细胞较圆，发育不完善(图1-G)，周围有散在的纺锤形或星形的幼稚成纤维细胞，结缔组织分布较少(图1-H)；3，4月龄羔羊睾丸间质内血管内皮细胞发育完善,巨噬细胞位于间质血管周围,细胞较大,形态不规则,结缔组织有所增加(图1-I,1-J)；5，6月龄羔羊睾丸间质内毛细血管数量增多，管壁内皮细胞包围成形，成纤维细胞呈长索状，轮廓清楚，核仁大而明显，结缔组织明显增加(图1-K,1-L).

A：1月龄睾丸间质，H.E染色，1000×；B：2月龄睾丸间质，H.E染色，1000×；C：3月龄睾丸间质，H.E染色，1000×；D：4月龄睾丸间质，H.E染色，1000×；E：5月龄睾丸间质，H.E染色，1000×；F：6月龄睾丸间质，H.E染色，1000×；G：1月龄睾丸间质，Masson染色，1000×；H：2月龄睾丸间质，Masson染色，1000×；I：3月龄睾丸间质，Masson染色，1000×；J：4月龄睾丸间质，Masson染色，1000×；K：5月龄睾丸间质，Masson染色，1000×；L：6月龄睾丸间质，Masson染色，1000×.↓：指示字母所标注的组织；Ley：leydig细胞；B：睾丸间质血管.图1　藏绵羊羔羊睾丸leydig细胞光镜下的结构特征Fig.1　The structural features of Tibetan sheep lamb’s leydig cells under the light microscope

2.2睾丸leydig细胞超微结构特征

电镜下观察，1月龄羔羊睾丸leydig细胞发育不成熟，体积较小，核内染色质含量较多，可见其胞浆内含大量游离核糖体,胞质较暗.间质内出现幼稚型血管内皮细胞及成纤维细胞(图2-A)；2月龄的羔羊睾丸leydig细胞体积有所增大，细胞数目增多，核着色深,线粒体明显增多,含有丰富的滑面内质网及较多的脂滴,高尔基复合体也较发达,血管内皮细胞结构明显(图2-B)；3月龄的羔羊睾丸leydig细胞体积明显增大，可见少量粗面内质网，胞浆内有少量分泌性颗粒出现(图2-C)；4月龄的羔羊睾丸leydig细胞体积大，核仁明显，分泌性颗粒增多(图2-D)；5，6月龄的羔羊睾丸leydig细胞胞浆内空泡及分泌性颗粒明显增多，巨噬细胞明显，毛细血管发育成熟，间质结构清晰，分泌性颗粒明显(图2-E,2-F).

A：1月龄睾丸间质，5000×；B：2月龄睾丸间质，5000×；C：3月龄睾丸间质，5000×；D：4月龄睾丸间质，5000×；E：5月龄睾丸间质，5000×；F：6月龄睾丸间质，5000×.↓：指示字母所标注的组织；Ley ：leydig细胞；B：睾丸间质血管；M：巨噬细胞；VEC：血管内皮细胞；IF：成纤维细胞.图2　藏绵羊羔羊睾丸leydig细胞电镜下的结构特征Fig.2　The structural features of Tibetan sheep lamb’s leydig cells in the electron microscope

2.3睾丸leydig细胞形态计量学统计

统计表明，随月龄的增加，藏绵羊羔羊睾丸大小发生明显变化.leydig细胞数量逐渐增加，3月龄leydig细胞数量最多.4月龄及以后leydig细胞数量出现明显下降.leydig细胞面积前5个月龄变化不大明显，但6月龄显著增大(P<0.05)，从5月龄的(33.79±4.74) μm2变化为6月龄的(55.33±8.71)μm2(表1，图3).

3讨论

哺乳动物睾丸leydig细胞的主要功能是分泌雄性激素并产生细胞调节因子.胚胎早期睾丸leydig细胞分泌的雄激素主要是诱导胚胎期性器官的分化和发育，而胎儿出生前后睾丸所分泌的雄激素主要是诱导中枢神系统中丘脑下部的性分化.动物发育至初情期，促性腺激素大量分泌期间，leydig细胞迅速增殖，此时分泌的雄性激素主要是促进第二性征的出现[5,6].刘慧雯等[7]报道大鼠睾丸leydig细胞发育存在两个细胞增殖峰，分别在胚胎期17～19 d和生后4周.本研究中藏绵羊羔羊睾丸leydig细胞在3月龄之前数量不断增加，5，6月龄时与3月龄无明显差异；4月龄时leydig细胞内脂质蓄积显著增加，6月龄时leydig细胞数量变化不明显，但是细胞面积增加显著.表明3月龄之前睾丸leydig细胞处于增殖期，数量不断增加；4月龄以后逐渐发育成熟，胞质中出现分泌颗粒，为合成分泌雄性激素做准备.

表1　不同年龄藏绵羊羔羊睾丸间质组织特征指数

同列肩标不同字母的表示差异显著(P<0.05)，相同字母的表示差异不显著(P>0.05).

图3　不同年龄藏绵羊羔羊睾丸间质组织特征指数Fig.3 　The organizational characteristic index ofTibetan Plateau Lamb testis

leydig细胞超微结构变化在一定程度上反映了其功能状态.季节性发情动物在非繁殖季节leydig细胞脂质蓄积，在胚胎或新生儿的leydig细胞中也会有脂质蓄积，从青春期开始，睾丸leydig细胞受垂体前叶分泌的leydig细胞刺激，能合成分泌雄性激素，可促进精子发生和雄性生殖器官发育，以及维持第二性征和性功能[8].据Christ opher等[8]的研究报道，袋鼠leydig细胞的脂质含量初生时增加，10 d后下降，60 d以后又出现增加，与其睾酮水平变化相一致.本研究中，4、5、6月份leydig细胞数量增加不明显，但细胞面积变化显著.与超微结构观察相一致，4月龄以后睾丸leydig细胞体积变大，核仁明显，分泌性颗粒显著增多，这与甘卫东等[9]对人类睾丸早期发育阶段leydig细胞的研究相一致.胚胎期和青春期时的leydig细胞胞浆内常见脂质蓄积，处于不断发育中，雄性激素合成通路尚不具有活性.

研究表明，睾丸微循环担负着氧、激素、营养物质及代谢产物的供给和运输任务,并可依据睾丸的生理需求调节血流量,以维持其正常的生理机能.微血管分布于相邻生精小管形成多角形的结缔组织间隙.研究发现[10,12]，大鼠和人均是每3个生精小管围成一个三角形的结缔组织间隙，每个生精小管与6个生精小管相邻.孙英等[11]研究表明，成年藏绵羊每3～4个生精小管围成一个间隙，每个生精小管与5～8个生精小管相邻.睾丸间质微血管丰富，其对生精小管营养供应更为充足.本研究中藏绵羊羔羊生精小管周围的血管以及结缔组织随月龄增加逐渐发育.1月龄时生精小管之间没有形成明显的结缔组织外形结构，但到6月龄时已发育形成了三角形的间隙结构，表明间质结缔组织内微血管分布与生精小管发育有直接的关系.研究认为大鼠睾丸小叶单位面积内微血管的数目与生精小管数目比值与生精小管的功能之间存在一定联系[10,12].因此，本研究中，藏绵羊羔羊睾丸间质内的结缔组织随月龄的增加逐渐增多，间质内血管随月龄的增加逐渐发育完善.藏绵羊羔羊睾丸间质内结缔组织和血管的发育，一方面提示生精小管数量及管径的相应发育变化；另一方面也为leydig细胞的局部分泌调节提供支持.

哺乳动物睾丸间质中的免疫活性细胞主要是巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞,它们参与免疫监视、免疫调节和组织重建,对睾丸稳态具有重要作用.同时它们的功能和发育也受睾丸内环境，尤其是睾丸leydig细胞和sertoli细胞的影响[13].睾丸中的巨噬细胞分布在生精小管管壁外层及间质血管周围,数量恒定，且与睾丸中leydig细胞数量成1∶4的固定比例.其常位于leydig细胞附近，leydig细胞突起伸入巨噬细胞表面的凹陷内时可被其吞噬.活化的睾丸巨噬细胞对leydig细胞产生既有诱导又有抑制作用,当巨噬细胞本身功能状态发生改变,对leydig细胞功能的影响也随之变化[14-15].本研究中，巨噬细胞明显出现于5、6月龄羔羊睾丸间质中，且在6月龄时其胞浆内分泌颗粒明显增加，表明其发育完善，为羔羊的进一步发育提供必要的免疫保障.

4结论

本研究表明，3月龄之前，藏绵羊羔羊leydig细胞处于胚胎型向成熟型过渡时期，数量不断增加；4月龄以后逐渐发育成熟，为leydig细胞的局部分泌调节提供结构支持，对生精小管的进一步发育以及后期精子发生具有重要意义.

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(责任编辑胡文忠)

Structure characteristics of leydig cell in Tibetan

sheep lamb at different ages

LU Yu-rong,YUAN Li-gang,WANG Xun,ZHANG Hui,GAN Li-peng,HUANG Ning,

YAN Zhen-long,CHEN Guo-juan,ZHANG Ji-wen

(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：This experiment was conducted to investigate the structure characteristics of the Tibetan sheep lamb's leydig cells at different months.This study uses histochemistry and transmission electron microscope methods to characterize the microstructure and ultrastructure of the leydig cells in Tibetan sheep lamb's testis.The observations made with the light microscope were obvious morphological changes at different ages,the leydig cells were scattered in the interstitial connective tissue which were abundant with collagen between the seminiferous tubules,its development were inmature before 3-month-old and the numbers were increasing;although,the macrophages shaped irregularly were located near the interstitial blood vessel with the interstitial vascular endothelial cells were developed enough at 3～4 month old,after that,the lipid droplets in Leydig cells were appeared occasionally,the volume of leydig cells were not changed but interstitial tissues has further increased and abundant with collagen.The electron microscopic studies show that the leydig cells were oval with round shaped nuclei and many heterochromatin before 3-month-old,but the cell's volume changed more largely just development over 3-month old and appeared few secretory granules.In 4 month growth,the Leydig cells were irregularly shaped nuclei with prominent nucleoli,the vacuoles and secretory granules were present obviously,interstitial fibroblasts were long in shape and the blood vessels wall were surrounded by endothelial cells.Taken together,the leydig cells in the Tibetan sheep lamb's were in the transition period which developed from embryonal type to a mature stage before 3 months;but became gradually mature after that,the study providing the structural support for the local secretion of leydig cells,it is very important for the further development of seminiferous tubule and the late spermatogenesis.

Key words：Tibetan sheep lamb;testis;leydig cells;interstitial tissue

收稿日期：2014-12-10；修回日期：2015-03-16

基金项目：甘肃省2012年财政厅高等学校基本科研业务费项目；甘肃农业大学国家级大学生创新创业训练计划项目(201310733006).

通信作者：袁莉刚，女，教授，硕士导师，研究方向为动物发育生物学.E-mail:yuan2918@126.com

中图分类号：S 852.16+2

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2015)06-0012-06