曹焱，孟庆峰，刁秋实，张文达，刘刚

(1.黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨150081；2.黑龙江省林业科学院；3.黑龙江省林副特产研究所)

植物生长调节物质对成熟红松合子胚愈伤组织诱导的影响

曹焱1，孟庆峰2，刁秋实1，张文达1，刘刚3*

(1.黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨150081；2.黑龙江省林业科学院；3.黑龙江省林副特产研究所)

诱导成熟红松合子胚愈伤组织的关键，是选择正确的诱导培养基以及适宜浓度及配比的生长调节物质。结合松柏类针叶树种体胚发生文献，从7种基本培养基中筛选出LM培养基为最佳诱导培养基；在植物生长调节物质的筛选中，2,4-D优于NAA；LM+2 mg/L 2.4-D+(0～0.5)mg/L 6-BA可以诱导出更多的Ⅱ型有效愈伤组织；LM+2mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA的诱导培养基中加入0.5mg/L KT或0.5mg/L TDZ，可显著提高有效愈伤组织的诱导率(75.7%)。

红松合子胚；生长调节物质；有效愈伤组织

红松是温带地带性顶级群落——阔叶红松林的建群树种，同时是我国乃至东亚地区极其重要的优质珍贵用材树种和坚果经济林树种，其生态学上、经济学上和社会学上的重要地位无可替代。红松愈伤组织培养到现在为止，国内外相关研究实例报道较少，但少数实例证明此种培养方式可行。本实验探讨了基本培养基的筛选，植物生长调节剂的应用，以及组合对成熟红松合子胚有效愈伤组织的诱导的影响，以便对后续发生提供技术支持基础。

1 实验材料和测定内容

本实验均以完整成熟合子胚为外植体，培养基中均附加酸水解酪蛋白(CH)500mg/L，谷氨酰胺450 mg/L，蔗糖3%，琼脂0.6%，pH值5.8。暗培养。

1.1 基本培养基的选择

经研究者前期试验观察并结合文献总结，选出7种初始诱导培养基LM、1/2 LM、LP、DCR、MSG、S、BM作为基本培养基，不加激素的基本培养基分别作为对照。表1为诱导培养基及激素组合。

表1 红松合子胚诱导培养基及激素组合 mg·L-1

1.2 植物生长调节物质对红松愈伤组织诱导的影响

1.2.1 分别添加0.5、1、1.5、2 mg/L NAA和2,4-D于同一种基本培养基中，比较两种生长素对愈伤组织诱导的影响。

1.2.2 培养基中加入0、0.5、1、1.5、2 mg/L 2,4-D与0、0.5、1、2 mg/L 6-BA的不同组合，观察不同组合的生长素和细胞分裂素对红松愈伤组织诱导的影响。

1.2.3 在固定基本培养基和激素中分别加入0.1、0.5、1 mg/L KT、0.01、0.1、0.3、0.5 mg/L TDZ、0.1、0.3、0.5 mg/L ZT。比较其对红松愈伤组织诱导的影响。

2 结果与分析

2.1 基本培养基的筛选

成熟胚置于LM、1/2 LM、LP、DCR、MSG、S、BM培养基中，每种培养基设两种2,4-D浓度，诱导出愈伤组织率结果如图1。7种不同基本培养基相同激素浓度愈伤诱导率差异不显著(P<0.05)，但产生的愈伤组织形态及愈伤组织发育状况各异。

图1 7种培养基在不同2,4-D浓度下红松合子胚愈伤组织诱导率

根据Arm strong标准，30 d左右定期观察，LM培养基产生的愈伤组织多类似于Ⅱ型有效愈伤组织，具有透明鲜活丝状和小颗粒状的形态，因此将LM培养基作为初始诱导基本培养基。

2.2 NAA与2,4-D 组合对愈伤组织诱导效果

以LM为基本培养基，均添加0.5mg/L 6-BA，其他条件不变，分别加入不同浓度的NAA和2,4-D。图2表明，使用NAA的诱导率明显低于使用2,4-D的。较为适宜的诱导生长素为2,4-D，适宜浓度2 mg/L。

图2 LM培养基中分别加入NAA和2,4-D对诱导红松合子胚愈伤组织的差异

2.3 2,4-D与6-BA不同组合对愈伤组织诱导的影响

接种21 d后观察，生长素2,4-D含量越高，愈伤组织量越大。但随着2,4-D浓度的升高，褐化率也逐渐升高。2,4-D和6-BA的浓度配比影响着愈伤组织的形态，生长素2,4-D浓度大于细胞分裂素6-BA的浓度，且浓度差较大，诱导出多为透明、疏松、鲜活的有效愈伤组织；生长素浓度等于或小于细胞分裂素浓度时，促进胚的器官发生，多产生不定芽，不适宜愈伤组织的诱导；另外，生长素的初始浓度过低则不能诱导出有效愈伤组织。

因此初始诱导阶段，应将生长素2,4-D的浓度置于2 mg/L，并附加0～0.5 mg/L 的6-BA。

2.4 添加其他激素对愈伤组织诱导效果

LM+2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA为对照，分别加入不同浓度的KT、TDZ、ZT，接种60 d后记录其有效愈伤组织分化状况(期间接种30 d后按原有激素水平继代一次)。从表2中可见，加入0.5 mg/L KT的诱导培养基有效愈伤组织诱导率高达75.7%，与其他培养基的差异显著(P<0.05)。诱导出的愈伤组织多具备Ⅱ型有效愈伤组织的特征，在后面的继代中，该种愈伤组织也表现出很强的分化增生能力，且不容易褐化死亡。ZT所产生的有效愈伤组织易干燥变硬，表明选用的ZT含量不适合有效愈伤的诱导；TDZ在0.5mg/L时诱导率很高，其诱导出的有效愈伤组织具有特殊的薄脆质感，在解剖镜下观察表面有胚柄伸出，以及小细胞团突起，疑似早期原胚团。这表明，TDZ对诱导胚性愈伤组织有一定促进作用，在添加适量TDZ的情况下有可能产生胚性愈伤组织并有希望获得体细胞胚。试验中产生的淡黄色疏松有效愈伤组织，分化旺盛，很可能是胚性愈伤组织，但处于分化过盛的徒长状态，进一步培养不容易向体胚方向转化。

综上，诱导红松的有效愈伤组织，应在加入适量生长素和细胞分裂素的同时，再加入一定浓度的KT或TDZ，这将会促进胚性愈伤组织的形成。

表2 2,4-D与6-BA不同浓度配比对红松合子胚愈伤组织诱导情况

注：愈伤组织状态为产生量较大记为+++,产生量一般记为++,只胚根处不明显愈伤记为+；部分褐化记为+++,贴近培养基部分褐化记为++,胚根处褐化记为+。

表3 KT、TDZ、ZT对红松合子胚愈伤组织的诱导情况

注：有效愈伤组织旺盛分化记为+++,分化量一般记为++,少量分化并褐化记为+。

3 结论

3.1 不同的培养基对有效愈伤组织的诱导效果不同，初始诱导应选用盐浓度较高的LM培养基使外植体完全脱分化，反复继代后可以产生有效愈伤组织；供试的其他培养基继代后极少产生有效愈伤组织。

3.2 不同的激素组合和浓度配比对有效愈伤组织的诱导率影响不同，在红松愈伤组织的诱导中，2,4-D是愈伤组织启动的不可或缺的植物生长调节剂，其作用远远大于NAA；另外在LM + 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L 6-BA的诱导培养基中加入0.5 mg/L KT或0.5 mg/L TDZ，可显著提高有效愈伤组织的诱导率(75.7%)。

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Plant Growth Regulators Effect on Callus Induction from Mature Zygotic Embryos ofPinuskoraiensis

Cao Yan1,Meng Qingfeng2,Diao Qiushi1,Zhang Wenda1,Liu Gang3*

(1.Forestry Research Institute of Heilongjiang Province,150081;2.Heilongjiang Academy of Forestry;3.Forest By-product and Speciality Institute in Heilongjiang Province)

The induction key of callus from mature zygotic embryos ofPinuskoraiensisis to choose the right medium and the concentration ratio of growth regulators. Under the literature on conifers of conifer somatic embryos.Screened LM medium from 7 basic medium arguing that it was the best;in screening of plant growth-regulator substances, the author argues that 2,4-D is better than NAA. And the substances of LM+2mg/L 2,4-D+(0-0.5)mg/L 6-BA can induce more effective callus of type II. Add 0.5mg/L KT or 0.5mg/L TDZ to LM+2mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA induction medium, can significantly increase the effective induction frequency of callus.

Zygotic embryos ofPinuskoraiensis; Growth regulators; Effective callus

2015-03-16

省属科研院所基本科研业务费专项

曹焱(1982-)，女，森林培育学硕士，助理研究员，主要从事森林培育相关技术及林木育种方面的研究工作；*

S791.247

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.03.004