李萍，王俊岭，江智龙，杨秋辉，刘丹，李斯(天津市第二人民医院，天津市肝病医学研究所，天津00000; 天津医科大学研究生院;天津中医药大学)

转染Smad3-siRNA的活化肝星状细胞Smad3表达及细胞外基质分泌量变化

李萍1，王俊岭2，江智龙3，杨秋辉2，刘丹3，李斯3
(1天津市第二人民医院，天津市肝病医学研究所，天津300000; 2天津医科大学研究生院;3天津中医药大学)

摘要:目的转染Smad3-siRNA的活化肝星状细胞(HSCs)Smad3表达及细胞外基质分泌量变化。方法利用生物软件进行Smad3mRNA模拟，选择合适的靶位点，使用pSilencer3.1-H1-hygro载体表达Smad3特异性siRNA。将Smad3-siRNA真核表达载体转染HSC-T6细胞株，将HSC-T6细胞接种到24孔培养板，待细胞生长融合达60%～80%后，每3孔为1组，共分为4组，HSC-T6组细胞未经过质粒转染;空白质粒组细胞经过不含Smad3-siRNA的空白质粒转染; 1 μg Smad3-siRNA转染组细胞经过含有1 μg Smad3-siRNA的质粒转染; 2 μg Smad3-siRNA转染组细胞经过含有2 μg Smad3-siRNA的质粒转染。应用RT-PCR法、Western blotting法分别检测Smad3mRNA和蛋白，同时检测细胞上清胶原Ⅲ。结果成功构建siRNA表达克隆。HSC-T6组、空白质粒组、1 μg Smad3-siRNA组、2 μg Smad3-siRNA组的Smad3mRNA相对表达量分别为0.98±0.06、0.98±0.10、0.72±0.10、0.31±0.15，Smad3蛋白相对表达量分别为0.98±0.01、0.96±0.02、0.73±0.03、0.30±0.02，胶原Ⅲ含量分别为33.11±0.45、33.55± 1.00、17.93±1.05、11.80±1.31，1 μg Smad3-siRNA组、2 μg Smad3-siRNA组分别与HSC-T6组比较，1 μg Smad3-siRNA组、2 μg Smad3-siRNA组分别与空白质粒组比较，1 μg Smad3-siRNA组与2 μg Smad3-siRNA组比较，P均＜0.05。结论在体外实验中真核表达载体Smad3-siRNA可有效地抑制HSCs中Smad3的表达，并可减少激活的HSCs分泌细胞外基质。

关键词:肝星状细胞; Smad3-siRNA真核表达载体;转化生长因子β

研究［1］显示，活化的肝星状细胞(HSCs)是肝纤维化的细胞学基础，转化生长因子β(TGF-β)信号途径在肝脏纤维化中发挥重要作用。Smad3在信号传输途径中处于中枢地位，将TGF-β的信号传递到核内，调节靶基因的转录并诱导下游基因的表达［2，3］。RNA干扰技术为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具。本研究针对Smad3基因设计RNAi的真核表达载体，特异性干扰Smad3的基因的表达，以确定其能否对活化的HSCs产生作用。

1　材料与方法

1.1细胞株、质粒含H1启动子的转录载体pSilencer3.1-H1-siRNAhygro质粒购于美国Ambion公司，HSC-T6细胞株由美国纽约西奈山医学院Friedman教授惠赠。

1.2主要试剂T4DNA连接酶、T4磷酸激酶、SalⅠ(大连宝生物公司)，脂质体转染试剂Metafectene(德国Biontex公司)，胶原ⅢELISA试剂盒(Uscnlife公司)。

1.3设计软件采用Ambion公司的设计软件设计合成针对Smad3基因shRNA的寡核苷酸序列。有效靶序列: 5'-AACGTGAACACCAAGTGCATT-3'(Smad3mRNA第492位，GenBank NM_016769)。DNA寡核苷酸单链按照表达shRNA的原则设计，由上海博亚生物技术有限公司合成。其shRNA的DNA Olig: 5'-GATCCGCGTGAACACCAAGTGCATTCTATGGACAAATGCACTTGGTGTTCACGTTTTTTGTCGACA-3'互补链3'-GCGCACTTGTGGTTCACGTAAGATACCTGTTTACGTGAACCACAAGTGCAAAAAACAGCTGTTCGA-5'内含BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ酶切位点。正、负DNA寡核苷酸单链经退火后可形成具有黏性末端的DNA双链，磷酸化处理后，并可进一步与经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后的pSilencer3.1-H1-hygro载体连接，转化DH5α大肠杆菌，挑取重组阳性克隆行酶切鉴定及测序鉴定。构建成转录siRNA的质粒以及实验空白对照质粒。

1.4 Smad3-siRNA真核表达载体转染待细胞生长融合达60%～80%后，利用脂质体Metafectene转染表达siRNA pSilencer3.1-H1-hygro质粒，混合比例为

1∶4(质量∶体积)，转染步骤按说明书进行。转染后6 h，换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，48 h后抽提总RNA和总蛋白进行检测。

1.5 HSC-T6细胞Smad3mRNA检测采用RTPCR法。将HSC-T6细胞接种到24孔培养板，待细胞生长融合达60%～80%后，每3孔为1组，共分为4组，HSC-T6组细胞未经过质粒转染;空白质粒组细胞经过不含Smad3-siRNA的空白质粒转染; 1 μg Smad3-siRNA转染组细胞经过含有1 μg Smad3-siRNA的质粒转染; 2 μg Smad3-siRNA转染组细胞经过含有2 μg Smad3-siRNA的质粒转染。各组干预48 h后，24孔板每孔加人500 μL TRIzol试剂，静置5min。枪头吹打后吸入离心管中，加人100 μL氯仿，离心后取上清加人异丙醇沉淀，抽提总RNA。Smad3引物使用Primer Premier5.0设计。序列: 5'-GAACGGGCAGGAGGAGAAAT-3'、5'-CCACAGGCGGCAGTAGATGA-3'，208 bp，反应条件为50℃、30min，94℃、4min，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、2min，30个循环，72℃、10min。RT-PCR产物以1%的琼脂糖凝胶电泳。以β-actin为内参照基因，正义链: 5'-CGCTGCGCTGGTCGACA-3';反义链: 5'-GTCAGGCACGATTTCCCGCT-3'，目的基因620 bp。mRNA表达采用Gel Scan软件进行灰度扫描，半定量分析。

1.6 HSC-T6细胞Smad3蛋白检测采用Westernblotting法。将HSC-T6细胞接种到24孔培养板，待细胞生长融合达60%～80%后，每3孔为1组，共分为4组，HSC-T6组细胞未经过质粒转染;空白质粒组细胞经过不含Smad3-siRNA的空白质粒转染; 1 μg Smad3-siRNA转染组细胞经过不含Smad3-siRNA的空白质粒转染; 2 μg Smad3-siRNA转染组细胞经过含有2 μg Smad3-siRNA的质粒转染。各组经48 h转染后，提取细胞蛋白，按照Biod-ford法测定蛋白水平。跑SDS-PAGE胶后，转膜1 h，5%的脱脂奶粉封闭2 h，以5%的脱脂奶粉稀释一抗Smad3抗体Santa Cruz公司(1∶200)，室温孵育2 h，4℃过夜;次日PBS洗10min×3，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗1∶2 000(5%的脱脂奶粉稀释)室温孵育2 h，PBS洗10min×3，ECL化学发光法显色。β-actin为内参照蛋白。蛋白表达采用Gel Scan软件进行灰度扫描，半定量分析。

1.7 HSC-T6细胞培养上清中胶原Ⅲ检测Smad3-siRNA转染HSC-T6细胞48 h后，按照说明书收取细胞上清液利用ELISA方法测定胶原Ⅲ含量。

1.8统计学方法采用SPSS15.0统计软件。符合正态分布的计量资料珋x±s表示，两组比较采用两独立样本t检验，实验组各组间是否存在显著性差异分析采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

经酶切鉴定，质粒Psilence3.1-H1-hygro序列里面2727的位置是有一个SalⅠ的酶切位点的，而在我们的插入序列里面设计了SalⅠ的酶切位点，如果插入正确，就应该能够被SalⅠ酶切出两条DNA条带，一条2 170 bp，另一条2 382 bp;而质粒Smad3-siRNA能被SalⅠ酶切出两条DNA条带，即均为插入正确的质粒。挑取已转化的质粒菌种测序。经测序，结果完全符合设计要求，详见图1。各组HSCT6细胞Smad3mRNA、蛋白表达及细胞上清中胶原Ⅲ含量比较见表1。

图1　Smad图3-siRNA重组质粒酶切鉴定电泳图

表1　各组HSC-T6细胞Smad3mRNA、蛋白表达及细胞上清中胶原Ⅲ含量比较()

表1　各组HSC-T6细胞Smad3mRNA、蛋白表达及细胞上清中胶原Ⅲ含量比较()

注:与HSC-T6组比较，*P＜0.05;与空白质粒组比较，△P＜0.05;与1 μg Smad3-siRNA组比较，#P＜0.05。

组别　Smad3mRNA　Smad3蛋白　　胶原Ⅲ(μg/mL)HSC-T6组0.98±0.06　0.98±0.01　33.11±0.45空白质粒组　0.98±0.10　0.96±0.02　33.55±1.00 1 μg Smad3-siRNA组　0.72±0.10＊△　0.73±0.03＊△　17.93±1.05＊△2 μg Smad3-siRNA组　0.31±0.15＊△#　0.30±0.02＊△#11.80±1.31＊△

3　讨论

尽管肝纤维化的防治和治疗研究取得了很大的进步，但是肝纤维化仍然是威胁人类健康的一个重要疾病。RNA干扰技术已被广泛应用于基因治疗和功能基因组学的研究中，并显示出良好的效果［4］。以载体形式在体内表达shRNA，是一种产生RNA干扰的良好方式，它与化学合成的双链RNA作用一致，且持续时间长、费用低，故适于推广应用［5，6］。siRNA除了可在哺乳动物细胞水平上阻断

基因的表达外，在动物水平上亦可特异而高效地抑制外源基因和内源基因(转基因鼠)的表达［7～9］。本实验选择Smad3基因，根据文献［10］的siRNA设计原则和Ambion网站提供的设计原则及设计软件设计siRNA进行干扰研究。

活化的HSCs在肝纤维化过程中起关键作用，是肝纤维化的细胞学基础。为增加siRNA的稳定性，我们设计了转录发夹状siRNA的DNA质粒，并且在5'端进行了磷酸化，因5'端磷酸化的siRNA其活性明显高于非磷酸化的siRNA。测序和酶切结果表明，含有发夹状siRNA的质粒序列与我们设计的相符。结果表明，我们设计的siRNA对Smad3产生了很好的抑制效果，转染表达RNAi干预HSC-T6细胞48 h后，Smad3mRNA、蛋白随干预剂量的增加表达下降，与空白质粒组及HSC-T6组比较，P均＜0.05。同时，2 μg Smad3-siRNA组与1 μg Smad3-siRNA组相比，P＜0.05。空白对照无论在RNA水平还是在蛋白水平上都没产生抑制作用，表明siRNA作用是序列特异性的。

另有研究［11，12］显示，Smad7具有抑制肝纤维化进展的作用，而Smad3参与肝纤维化进展。在Smad3受到阻断后，是否有其他Smad蛋白或信号传导通路如骨形态发生蛋白在起作用尚需要深入研究。本研究发现，细胞培养上清液中的胶原Ⅲ含量在1 μg Smad3-siRNA组与2 μg Smad3-siRNA组有明显下降，且空白质粒组及HSC-T6组比较P均＜0.05。同时，2 μg Smad3-siRNA组与1 μg Smad3-siRNA组相比P＜0.05。TGF-β1是组织纤维化病变中最重要的促发因子之一，TGF-β1相继与TGFβ-Ⅱ型受体、TGFβ-Ⅰ型受体结合，再与Smad2、Smad3结合，最后与Smad4结合形成异多聚体，才能进入核中调节转录活动。Smad3信号通路在调控TGF-β1介导的细胞外基质沉积过程中处于十分重要的地位，能介导TGF-β1信号传导，调节肝纤维化［13～15］。本实验表明阻断Smad3表达，使TGF-β1信号通路传导障碍，造成了HSCs胶原分泌的减少。因此，靶向调整Smad3的表达水平能有效降低肝细胞外基质，有望成为临床防治肝纤维化的一个有效途径。

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·临床研究·

收稿日期:( 2015-04-18)

通信作者:李萍

文章编号:1002-266X(2015)35-0031-03

文献标志码:A

中图分类号:R575

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.010