郑　芳，朱雪松，李　鹏，李志浩，李春雷，李　聪

(湖北医药学院附属东风医院药学部，武当特色中药研究湖北省重点实验室，湖北 十堰　442008)



◇药物分析◇

HPLC-DAD法测定“武当三号金银花”不同部位中芦丁和木犀草苷的含量

郑芳，朱雪松，李鹏，李志浩，李春雷，李聪

(湖北医药学院附属东风医院药学部，武当特色中药研究湖北省重点实验室，湖北 十堰442008)

摘要：目的建立HPLC-DAD法测定 “武当三号金银花” 不同部位中芦丁和木犀草苷的含量。方法采用Fortis Xi Phenyl柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为乙腈(A)—0.5%冰醋酸溶液(B)进行线性梯度洗脱；检测波长为354 nm；柱温：30℃。结果芦丁和木犀草苷在各自测定的范围内均呈良好的线性关系(r≥0.999 4)，平均回收率分别为99.4%、99.3%。结论该法操作简单，灵敏度高，重现性好，为控制“武当三号金银花” 不同部位芦丁和木犀草苷的质量提供了一种可靠的方法。

关键词：高效液相色谱法；芦丁；木犀草苷；梯度洗脱

“武当三号金银花”由湖北武当生物医药科技有限公司从山东亚特生态技术有限公司引进的亚特红金银花，经培育适合武当地区生长的优质金银花新品种[1]。该花呈红色，香味浓郁，抗逆性强。“武当三号金银花”为忍冬科植物忍冬(LoniceraJaponicaThunb.)的干燥花蕾或带初开的花，其藤和叶分别为忍冬的干燥茎枝和干燥叶。金银花、忍冬叶和忍冬藤均具有清热解毒、疏风通络之功效[2-4]。《中国药典》2010年版一部已将绿原酸和木犀草苷作为金银花质量控制的指标，将绿原酸和马钱苷作为忍冬藤质量控制的指标，但忍冬叶质量控制尚未入药典。忍冬叶为金银花和忍冬藤的副产物，虽产量较高，但一直被视为非药用部位而未得到充分利用[5]。金银花、忍冬叶和忍冬藤除了均含有机酸外，还均含有黄酮类等成分[6-8]。其中，以芦丁和木犀草苷为代表的黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗癌等多种药理作用[9-10]。目前，对“武当三号金银花”中芦丁和木犀草苷的含量测定未见报道。本研究参考有关文献[11-12]，经过多次试验，采用HPLC-DAD法测定“武当三号金银花”不同部位(花蕾、叶、藤)中芦丁和木犀草苷的含量，并各自取三批样品进行了含量测定。

1仪器与试药

1.1仪器UltiMate 3000 高效液相色谱仪(DIONEX)，配备UltiMate 3000 Photodiode Array Detector、UltiMate 3000 Pump(四元梯度)、LGC-1025M 型柱温箱、Chromeleon 色谱工作站及手动进样器；AEU-210型万分之一电子分析天平(日本岛津)；METTLER TOLEDO 十万分之一电子分析天平；KQ-500DE型数控超声波清洗器(功率200～500 W，额定频率40 kHZ，昆山市超声仪器有限公司)；KQ-100DB型数控超声波清洗器(功率100 W，频率40 kHZ，昆山市超声仪器有限公司)；FW100型高速万能粉碎机[额定频率(50±1) Hz，天津市泰斯特仪器有限公司]；GZX-DH-40X 4-5型电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。

1.2试药芦丁对照品(批号：100080-200707，中国药品生物制品检定所)；木犀草苷对照品(批号：111720-200604，中国药品生物制品检定所)；武当三号金银花及其叶和藤均于2014年5月18日、5月26日、6月4日采自湖北武当生物医药科技有限公司赛武当金银花种植基地，经湖北医药学院附属太和医院陈吉炎教授鉴定为忍冬科植物忍冬(LoniceraJaponicaThunb.)的干燥花蕾或带初开的花，其藤和叶分别为忍冬的干燥茎枝和干燥叶；乙腈和冰醋酸均为色谱纯，均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇和甲醇均为分析纯，均购自武汉市中天化工有限责任公司；水为自制注射用水。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备精密称取芦丁和木犀草苷对照品各适量，置棕色瓶中，加70%乙醇制成每1 mL中含芦丁0.104 mg和每1 mL中含木犀草苷0.124 mg的对照品储备液，均用封口膜封上，置4℃冰箱中备用；各取上述储备液适量混合得芦丁和木犀草苷混合对照品溶液(每1 mL中含芦丁和木犀草苷分别为34.67，41.33 μg)。

2.2供试品溶液的制备

2.2.1“武当三号金银花”花蕾供试品溶液[2]取“武当三号金银花”干燥花蕾[鲜品蒸制4 min后，于鼓风电热恒温干燥箱(45℃)干燥](过四号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称量，超声处理[功率250 W，频率40 kHz，超声温度(40±1)℃]30 min，放冷，再称量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm的有机相过滤头过滤，取续滤液适量，作为供试品溶液。

2.2.2“武当三号金银花”叶供试品溶液取“武当三号金银花”干燥叶[鲜品直接置于鼓风电热恒温干燥箱(45℃)干燥](过四号筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇30 mL，称量，超声处理[功率250 W，频率40 kHz，超声温度(40±1)℃]30 min，放冷，再称量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm的有机相过滤头过滤，取续滤液适量，作为供试品溶液。

2.2.3“武当三号金银花”藤供试品溶液取“武当三号金银花”干燥藤[鲜品直接置于鼓风电热恒温干燥箱(45℃)干燥](过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称量，超声处理[功率250 W，频率40 kHz，超声温度(40±1)℃]30 min，放冷，再称量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm的有机相过滤头过滤，取续滤液适量，作为供试品溶液。

2.3色谱条件与系统适应性试验色谱柱：Fortis Xi 苯基柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流动相：以乙腈为A相、0.5 %冰醋酸溶液为B相，进行梯度洗脱(0→14 min，A：14%，流速：0.6 mL·min-1；14→15 min，A：14%，流速：0.6→0.9 mL·min-1；15→35 min，A：14%→35%，流速：0.9→0.4 mL·min-1；35→40 min，A：35%→14%，流速：0.4→0.6 mL·min-1；40→46 min，A：14%，流速：0.6mL·min-1)；芦丁、木犀草苷检测波长为：354 nm；柱温：(30±1) ℃；进样量：5～20μL。在上述色谱条件下，进样“2.1”项下混合对照品溶液及“2.2”项下各供试品溶液，得色谱图如图1。结果：芦丁、木犀草苷保留时间分别约为28.2、32.1 min；理论塔板数按芦丁峰计均不低于60 000，按木犀草苷峰计均不低于80 000；各色谱图中芦丁和木犀草苷色谱峰的DAD匹配值均不低于999.20，说明各样品溶液中的芦丁和木犀草苷色谱峰均与相邻的色谱峰达到了基线分离。

2.4标准曲线的绘制分别进样“2.1”项下芦丁对照品储备液各0.208、0.416、0.832、1.248、1.664、2.08 μg和木犀草苷的对照品储备液各0.124、0.248、0.496、0.744、0.992、1.24 μg，记录各自峰面积。以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得芦丁和木犀草苷的回归方程分别为Y芦丁=76.96X-0.273 4(r=0.999 4)、Y木犀草苷=103.89X+0.775 3(r=0.999 6)，进样量的线性范围分别为0.208～2.08、0.124～1.24 μg。结果表明，芦丁和木犀草苷在各自的线性范围内均呈良好的线性关系。

2.5精密度试验精密吸取“2.1”项下的芦丁和木犀草苷混合对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，重复进样6次，记录各自的色谱峰面积，结果芦丁和木犀草苷色谱峰面积的RSD分别为0.73%、0.70%(n=6)。

2.6重复性试验取批号为20140518的“武当三号金银花”花蕾、叶、藤干燥粉末各6份，分别按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”项下的方法平行操作，制备供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件分别进样10 μL，记录峰面积。结果“武当三号金银花”花蕾、叶、藤中芦丁峰面积的RSD分别为1.96%、1.88%、1.92%(n=6)，木犀草苷峰面积的RSD分别为1.86%、1.90%、1.88%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.7稳定性试验取批号为20140518的“武当三号金银花”花蕾、叶、藤干燥粉末各1份，分别按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”项下的方法平行操作，制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、20、24 h进样，记录峰面积，结果“武当三号金银花”花蕾、叶、藤中芦丁峰面积的RSD分别为1.16%、1.28%、1.22%(n=7)，木犀草苷峰面积的RSD分别为1.26%、1.19%、1.23%(n=7)，表明上述各供试品溶液在24 h内稳定。

2.8加样回收率试验取批号为20140518的“武当三号金银花”叶干燥粉末(每1 g中含芦丁和木犀草苷分别为3.46、5.86 mg)12份，每份约0.2 g，精密称定，均分两组，一组分别精密加入芦丁对照品储备液(104.0 mg·L-1)7.0 mL，另一组精密加入木犀草苷对照品对照品储备液(124.0 mg·L-1)10.0 mL，按“2.2.2”项下的方法制备样品，依据“2.3”项下色谱方法各自进样10 μL，按外标法计算含量，结果见表1。

2.9样品含量测定分别取批号为20140518、20140526和20140604的“武当三号金银花”干燥花蕾、叶和藤，分别按“2.2.1”、“2.2.2” “2.2.3”项下的方法，制备各自的供试品溶液，并按“2.3”项下色谱条件测定芦丁和木犀草苷的峰面积，按外标法计算各自含量，结果见表2。

表1　加样回收率试验结果(n=6)

表2　“武当三号金银花”不同部位中芦丁和木犀草苷含量测定结果(n=3)

3讨论

3.1提取条件的确定

3.1.1“武当三号金银花”花蕾提取条件的确定本试验参考有关文献[1-2]，固定超声功率(250 W)、超声频率(40 kHz)、超声温度[(40±1)℃]及液料比(25 mL·g-1)，分别以60%乙醇、70%乙醇和80%乙醇为提取溶剂，对超声30、45、60 min提取方法进行了初步考察。结果超声30 min和超声45、60 min时芦丁和木犀草苷的含量相差不大；以60%乙醇和70%乙醇提取芦丁和木犀草苷时，二者含量均无显著性差异(以60%乙醇提取时芦丁的含量比木犀草苷的稍高，当以70%乙醇提取时，则木犀草苷的含量稍高)，但均高于用80%乙醇提取时的含量。故武当三号金银花提取芦丁和木犀草苷的条件初步确定为：以70%乙醇为提取溶剂，超声[功率：250 W、频率：40 kHz、温度：(40±1)℃]提取30 min。

3.1.2“武当三号金银花”叶提取条件的确定本试验分别对超声提取[固定超声频率为40 kHz和超声温度为(40±1)℃，考察功率分别为100、250、500 W和超声时间分别为30、45、60 min时的提取效果]、提取溶剂(分别为60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇和50%甲醇)、和液料比(分别为50、100、150 mL·g-1)几种单因素试验进行了初步的考察。结果在固定超声频率(40 kHz)和超声温度[(40±1)℃]下，以超声功率分别为250、500 W和提取时间分别为30、45、60 min时，芦丁和木犀草苷提取率没有显著的差别，从节省时间、节约能源和提取后杂质相对少等几方面综合考虑，将该试验超声提取功率和时间分别定为250 W和30 min；在上述超声条件下，当以60%乙醇为提取溶剂，液料比为150 mL·g-1时，芦丁和木犀草苷提取率相对较高。故“武当三号金银花”叶提取芦丁和木犀草苷的条件初步确定为：以60%乙醇为提取溶剂，液料比为150 mL·g-1，超声[功率：250 W、频率：40 kHz、温度：(40±1)℃]提取30 min。

3.1.3“武当三号金银花”藤提取条件的确定本试验参考有关文献[1-2]，分别对超声提取(方法同“3.1.2”项下)、提取溶剂(70%乙醇和50%甲醇)和液料比(25、50 mL·g-1)几种单因素试验进行了初步的考察。结果以70%乙醇为提取溶剂，液料比为50 mL·g-1，超声提取[超声频率、温度、功率分别定为40 kHz、(40±1)℃、250 W和30 min]时，芦丁和木犀草苷提取率相对高些。

3.2检测波长的确定依照“2.3”项的色谱条件，进样“2.1”项下芦丁和木犀草苷混合对照品溶液，由Ultimate3000二极管阵列检测器对芦丁和木犀草苷色谱峰的在线紫外扫描(波长范围：190～400 nm)图谱得知：芦丁和木犀草苷分别在约354、348 nm波长处有最大吸收，该试验可以把芦丁和木犀草苷检测波长分别定为：354和348 nm。但从图谱上分析，对于木犀草苷采用芦丁的最大吸收波长(λ=354 nm)定量，或对于芦丁采用木犀草苷的最大吸收波长(λ=348 nm)定量均差别不大。为了简化该试验，又考虑到同一供试品进样时，芦丁的峰面积比木犀草苷的低，因此该试验最终将芦丁和木犀草苷的检测波长定为354 nm。

3.3色谱柱的选择《中国药典》2010年版一部对金银花中木犀草苷的含量测定采用的色谱柱为苯基柱(Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6 mm×250 mm，5 μm)，本试验参考相关文献[1-2,8]，分别采用苯基柱(Fortis Xi phenyl 4.6 mm×250 mm,5 μm)和C18柱(Fortis 4.6 mm×250 mm，5 μm)同时测定芦丁和木犀草苷的含量，当采用苯基柱时，二主峰的理论塔板数均不低于60 000，而采用C18柱时，二主峰的理论塔板数均低于20 000，并且二主峰与相邻峰的分离度，前者均大于后者，故本试验最终采用苯基柱测定“武当三号金银花”不同部位中芦丁和木犀草苷的含量。

3.4含量测定的结果由表2含量测定结果可知：“武当三号金银花”的花蕾、叶和藤中芦丁和木犀草苷的含量高低均为：叶>花蕾>藤,其中叶中木犀草苷的含量几乎为《中国药典》2010年版一部规定的金银花(含木犀草苷不得少于0.05%)的10倍以上。虽然藤中木犀草苷的含量相对于叶和花蕾而言最低，但其含量却高于药典中金银花中木犀草苷的标准近3倍。《中国药典》2010年版一部规定：金银花的质控指标为绿原酸和木犀草苷(不得少于0.05%)，无芦丁作为质控标准；规定忍冬藤的质控指标为绿原酸和马钱苷，无芦丁和木犀草苷作为质控标准；对于忍冬叶，药典中无任何质控指标。忍冬藤和叶是生产金银花的副产品，一年四季均可采收，资源丰富，若加以合理开发利用，可以大大缓解市场上金银花药材的紧缺。“武当三号金银花”不同部位的黄酮类的含量与同一地区其他品种的金银花的对应部位相比均较高(笔者已经对武当地区其他品种的金银花做过初步的对比研究)，并且，黄酮具有较强抗氧化能力，因此笔者推测其药性也应与其他品种有所不同，入药时应视病情进行定量。

4结论

本试验采用反相高效液相色谱法—二极管阵列检测器对“武当三号金银花” 不同部位(花蕾、叶、藤)中黄酮类物质——芦丁和木犀草苷的含量进行测定，结果，该方法操作简便、重现性好、专属性强，测定结果稳定可靠，以期为“武当三号金银花”的花蕾、叶和藤质量标准的制定提供参考。

参考文献：

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.015

基金项目：湖北省2011协同创新中心基金(鄂教科函(2012)56号)

作者简介：郑芳，女，主任药师，研究方向：医院药学，E-mail：zhengfangdf@163.com

通信作者：朱雪松，男，主任药师，研究方向：医院药学与临床药学，E-mail：dfpharmacy@163.com

(收稿日期：2015-02-13,修回日期：2015-07-20)

Determination of the contents of rutin and luteoloside in different parts
of “Wudang Ⅲ Flos lonicerae” by HPLC-DAD

ZHENG Fang,ZHU Xue-song,LI Peng,et al

(DepartmentofPharmacy,DongfengHospitalAffiliatedtoHubeiMedicalUniversity,HubeiKeyLaboratoryof

WudangLocalChineseMedicineResearch,Shiyan,Hubei442008,China)

Abstract:ObjectiveTo determine the contents of rutin and luteoloside in different parts of “Wudang Ⅲ Flos lonicerae”by HPLC-DAD.MethodsFortis Xi Phenyl column(250 mm×4.6 mm,5 μm)was used.The mobile phase was acetonitrile(A)-0.5% glacial acetic acid aqueous solution(B)with gradient elution.The detective wavelength was 354 nm.The column temperature was 30℃.ResultsThe rutin and luteoloside showed good linearity(r≥0.999 4)in a detection range and the average recovery rates were 99.4%,99.3%，respectively.ConclusionThe method is simple，sensitive and reproducible，which can be used to control the quality of rutin and luteoloside in different parts of “Wudang Ⅲ Flos lonicerae”.

Key words：HPLC;rutin;luteoloside;gradient elution