赵文龙 ，文鹏程，赵 鹏，杨秀环，程柏丛，陈 余，何 诚

链格孢霉（Alternaria alternata）是污染食物和饲料真菌之一，广泛分布于泥土和植物里,包括谷物、蔬菜、水果以及田间作物。1984 年对河南省8 个县的粮食真菌做了分离培养，链格孢霉的检出率高达82.2%，并且食管癌高发区与低发区有非常显著性差异[1]。链格孢霉对动植物的毒性作用已有报道，如20 世纪40 年代俄国曾发生发霉谷物引起的中毒事件，从食用发霉谷物里分离出多种链格孢霉。用从烟草里分离出的长柄链格孢（Alternaria longipes）的产毒培养物喂饲雏鸡，结果出现食欲不振、昏睡、腹泻、肌无力和昏迷，4～8 d 出现死亡，培养物导致33%的雏鸡死亡，存活鸡只发育严重迟缓。病理检查发现肌胃出血和溃疡[1]。链格孢霉污染谷物喂饲雏鸡，3 d 后出现腹泻、行动迟缓以及出血症候群引起的衰竭直至死亡，第4 天全部死亡[2]。此外，青霉菌也是主要谷物饲料产毒真菌之一，可产生青霉酸、桔青霉素，动物吃了污染饲料会因其产生大量的毒素对动物机体造成危害[3]。

北京某乳鸽场2013 年11 月至2014 年4 月，4 000 对肉种鸽出现持续性腹泻和呼吸困难，种鸽死亡率不足10%。15～23 日龄的乳鸽呈现张嘴喘式呼吸，发病率为80%～100%，累计死亡率高达90%。剖检见发病乳鸽、种鸽胸部、腹部气囊出现大量干酪样渗出物，肺脏、胰腺出现大量白色突起结节。

为了查清种鸽场的发病原因，分别取发病乳鸽、种鸽的肺脏组织进行了真菌和细菌培养。同时，取乳鸽主要饲料原料-玉米进行真菌培养。对培养的细菌和真菌进行鉴别，利用培养获得的真菌培养物分别通过口服途径接种9 日龄和25日龄健康AA肉鸡，进一步复制临床病理变化。同时，对种鸽场饲料原料、免疫程序进行调整，探讨防治种鸽高死亡病症的效果。

1 材料

1.1 动物与饲料 25 日龄乳鸽和325 日龄种鸽，来自北京怀柔县某发病的种鸽场；9 日龄、25 日龄AA肉鸡和雏鸡饲料，购自北京华都肉鸡公司。

1.2 设备 TDL5000B型低速冷冻多管离心机，上海安宁科学仪器厂；不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 培养基 改良马丁琼脂培养基和血液培养基，批号：20081006，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

2 方法

2.1 剖检和分离培养 25 日龄死亡乳鸽10 只，325日龄发病种鸽5 只，进行剖检。重点检查呼吸系统、泌尿系统和消化系统的病理学变化。同时，无菌取乳鸽、种鸽肺脏组织、肝脏组织接种马丁琼脂培养基和血液培养基，37 ℃培养24～72 h。

2.2 饲料前处理和培养 定量称取乳鸽发病期间使用玉米1 g，玉米破碎后加入30 mL 75%酒精浸泡1 h，1 000 r/min 离心10 min，取玉米沉渣放置在无菌培养皿中，加入改良马丁琼脂20 mL，25 ℃培养24～72 h 后，观察真菌生长特点。

2.3 细菌和真菌的鉴定 取改良马丁琼脂平板上典型的真菌菌丝，放置在载玻片上，滴加1 滴1%氢氧化钠溶液进行涂片，在显微镜下镜检。此外，选取血液培养基上的典型单个白色菌落送中国兽医药品监察所细菌室进行鉴定。鉴定后的典型菌落提取DNA，以16SrRNA为引物进行扩增，PCR 产物转入质粒后进行测序[4]。

2.4 动物回归试验 9 日龄肉鸡接种试验：将72 h 的2 种特征性的菌丝（Ⅰ型和Ⅱ型）用1 mL 的无菌生理盐水冲洗，再用生理盐水进行稀释至含有1×108个分生孢子/mL。将9 日龄20 只健康肉鸡分成4 组：A组5 只，喉头接种真菌培养物Ⅰ型；B组5 只，喉头接种真菌培养物Ⅱ型；C组5 只，喉头同时接种真菌培养Ⅰ、Ⅱ型；对照组5 只，接种等量的生理盐水。接种后，每天对鸡群进行临床观察，连续观察10 d。死亡的鸡进行剖检记录。

25 日龄肉鸡接种试验：将真菌培养物Ⅰ型喉头接种5 只25 日龄肉鸡，对照组接种同等剂量的生理盐水，接种后观察同上。

2.5 综合防治措施 针对乳鸽饲料霉变问题，彻底更换无霉变的玉米。同时，对收购的玉米进行批次检验，拒绝收购霉变饲料；在鸽子饮水中添加好利高（10%牛至油），剂量为每1 000 只乳鸽添加250 mL，种鸽添加500 mL，连续10 d。对于大群中持续性呼吸困难的种鸽260 对，实施扑杀和无害化处理；针对乳鸽新城疫免疫程序进行了调整：在14 d 和25 d 进行滴鼻点眼新城疫弱毒疫苗，剂量为0.025 mL/只，免疫后按照每30 天进行定期监测抗体变化。

3 结果

3.1 发病乳鸽和种鸽的剖检变化 乳鸽病变主要集中在肺脏、气囊、胰脏和肝脏上。肺脏出现灰白色结节样增生物，直径2～6 mm 不等（见中插彩版图1）。胸部气囊附着有大量的白色渗出物，或黄色干酪样渗出物。胰腺表面也出现大小不等的灰白色结节物（见中插彩版图2）。个别的肝脏表面出现小米粒样大小的白色结节。

种鸽：肺脏和胰腺组织上附着大量的白色结节物（见中插彩版图1-2）。胸气囊和腹部气囊附着大量的干酪样渗出物。肾脏普遍肿胀，但肝脏病变不显著。

3.2 鸽子病料和玉米分离培养结果 从发病乳鸽肺脏和玉米分离均获得2 种典型的真菌菌落。

菌落Ⅰ：48 h 菌落呈羊毛至绒毛状。72 h 菌落呈绿褐色或深褐色,背面呈黑色（见中插彩版图3）。显微镜下分生孢子梗深色,直立,长短不一,不分支,顶端单生或串生呈淡褐色至深褐色,砖隔状的分生孢子。分生孢子呈倒棍棒形、椭圆形或卵圆形,顶端有喙细胞（见中插彩版图4）。经过形态比对和文献检索，见中插彩版图4 中的真菌属于链格孢霉，又称黑霉菌[5]。

菌落Ⅱ：菌落生长较快，呈现白色絮状（见中插彩版图5）。分生孢子梗有横隔，光滑，基部无足细胞，分生孢子呈典型的扫帚状（见中插彩版图6）。

细菌分离培养：乳鸽肺脏和肝脏组织在血液培养基上同时培养出白色细小菌落，麦康凯培养基上出现白色小菌落。革兰染色为阴性、大小均一的短杆菌（见中插彩版图7）。以16SrRNA为引物进行扩增，其PCR 产物转入质粒后进行测序，与伤寒沙门菌参考菌株08-1736（accession#CP006602.1）和参考株798（accession#CP003386.1）的相似性均为99.0%。

3.3 动物回归试验 9 日龄肉鸡攻毒2 d 后，采食下降、精神委靡、呼吸困难（见中插彩版图8），3 d后，A组死亡4 只。B组接种后采集食物正常，无临床和无死亡发生。C组死亡3 只，临床表现与A组相同。对上述死亡的雏鸡进行剖检发现：气囊浑浊，肺脏呈现局灶性的出血，肺脏表面附着白色的结节，支气管出血，腹气囊上也见少量的白色结节（见中插彩版图9）。从肺脏中也分离出链格孢霉和青霉菌。

25 日龄肉鸡：接种后3 天，呈现喘式呼吸症状，未见有死亡。第7 天剖检后，胸气囊附着大量的白色渗出物，肺脏表面也出现白色的结节物。培养后分离出典型的链格孢霉。

3.4 采取综合措施后的防治效果 彻底更换霉变的玉米，饮水中添加好利高（10%牛至油）和硫酸铜溶液（0.05%），连续10 d。此外，难以治愈的种鸽坚决淘汰，种鸽群发病率显著下降，乳鸽发病率和死亡率控制在10%，出栏乳鸽的存活率达到92%，出栏体重也达到了上市的要求。

4 讨论

4.1 链格孢霉和青霉菌在乳鸽高死亡率发病中作用探讨 本试验中从发病鸽子肺脏和饲料中分离获得的链格孢霉和青霉菌，随后在肉鸡发病试验中，发现链格孢霉单独感染组、链格孢霉与青霉菌混合感染组均复制出了相似的临床呼吸困难症状和病理学变化。从肺脏病变中分离获得了链格孢霉和青霉菌。但是，青霉菌单独接种后肉鸡未出现死亡和典型的肺脏结节性病变。这显示链格孢霉是主要的致病性真菌，青霉菌属于条件性致病菌。链格孢霉污染可能在乳鸽顽固性肺炎和高死亡率中发挥主要作用。

本次乳鸽真菌病与以往报道烟曲霉感染蛋鸡的报道有所区别[6]。本次发病主要侵害气囊、肺脏、胰腺组织，其次是肾脏组织。而烟曲霉感染家禽后不但侵害肺脏、气囊、肾脏，而且侵害肝脏组织，造成肝硬化。但是链格孢霉和烟曲霉均能引起持续性发作性的呼吸困难和死亡。以往链格孢霉感染雏鸡死亡率达到33%，本次乳鸽的死亡率高达90%。肉鸡回归试验中死亡率达到80%，这说明链格孢霉造成的危害性大于烟曲霉的感染。烟曲霉感染主要侵害10 日龄左右的雏鸡，大于20 日龄的雏鸡发病率降低。本次链格孢霉感染25 日龄回归试验，复制出了临床呼吸道病症状，未见有死亡出现，这可能与观察时间短有关。但是本次发病种鸽出现10%的死亡，这也说明链格孢霉具有较高的致病性。Christensen 等用从食物和饲料里分离到的链格孢霉、曲霉、青霉和镰刀菌的培养物喂饲大鼠，链格孢霉、镰刀菌、曲霉菌、青霉菌的培养物造成死亡率分别为78%、61%、43%和7%[7]。这说明链格孢霉污染饲料造成的损失超过曲霉菌、青霉菌和镰刀菌。此外，本次乳鸽肺脏和肝脏组织中均分离出伤寒沙门菌，怀疑病鸽霉菌感染后机体抵抗力下降，产生免疫抑制，继发了沙门菌病的进一步感染[8]。

4.2 乳鸽链格孢霉感染的主要原因 据美国1984 年的谷物污染调查，230 份麦类样品中，链格孢霉侵染率达77%，268 株链格孢霉菌株中有101株产毒素，链格孢霉主要通过污染小麦，造成肌胃溃疡和腹泻[1]。但是玉米中污染链格孢霉造成家禽的发病尚未见报道。本次从乳鸽、种鸽的饲料原料玉米中分离获得了链格孢霉和青霉菌，且现场检查40%～50%玉米的胚芽出现褐色斑块。种鸽通过哺乳喂养给乳鸽，链格孢霉随鸽乳进入幼鸽消化系统、呼吸系统，导致气囊和肺脏感染。种鸽感染链格孢霉后，通过产生毒素，引起气囊、肺脏渗出性炎症，形成气囊纤维素性病变和结节性病变，由于呼吸性衰竭而被迫淘汰。

4.3 链格孢霉病防治的措施分析 定期对饲料原料进行真菌培养和分析，杜绝发霉饲料用于乳鸽和种鸽饲养。其次，采取人工鸽乳方式对乳鸽进行哺育，切断种鸽真菌病和沙门菌病向乳鸽传播，减少发病的风险。同时，针对种鸽沙门菌感染问题，采取定期检测和诊断，淘汰阳性种鸽群，杜绝垂直传播，保证乳鸽食品卫生安全。

5 结论

通过病原分离、鉴定和动物回归试验证明链格孢霉感染可以造成乳鸽、种鸽结节性肺炎和乳鸽的高死亡率。玉米饲料污染大量的链格孢霉是发病的主要因素，养殖企业也要高度重视链格孢霉污染饲料后的危害性。

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