段冉冉　彭　涛　李燕飞　高慧丽　王笑寒　王景涛　滕军放　贾延劼(郑州大学第一附属医院神经内科　河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南　郑州　450000)

阿尔茨海默病患者血浆microRNA-101a-3p的表达

段冉冉彭涛李燕飞高慧丽王笑寒王景涛滕军放贾延劼
(郑州大学第一附属医院神经内科河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南郑州450000)

〔摘要〕目的探讨microRNA在阿尔茨海默病(AD)患者血浆中的差异变化，以寻求一个可能作为辅助诊断AD的早期生物标志物。方法实验分为患者组和健康对照组，分别取其血浆并提取microRNA，利用microRNA基因芯片和荧光定量PCR的方法寻找有表达差异的microRNA。结果基因芯片筛选出68个AD相关的差异表达microRNAs基因(P＜0．05)，其中miR-101a的表达水平在AD患者中显著低于对照组(log=－5．53，P =1．19×10－5)，选定为感兴趣miRNA;荧光定量PCR示:患者组中miR-101a的相对表达量为8.834×10－4±2.842×10－4，对照组为6.305×10－3±1.161 ×10－3。患者组表达量仅为对照组14％，两组间差异有统计学意义(F= 21．76，P＜0．001)，结果与miRNA芯片检测结果一致。ROC示:如果以0．002 163为诊断临界值，即miR-101a相对表达量低于0．002 163提示诊断AD。结论miR-101a可能通过多种途径影响AD的发生发展，可能作为一种辅助诊断AD的早期生物标志物。

〔关键词〕阿尔茨海默病; microRNA

第一作者:段冉冉(1989-)，女，硕士，主要从事阿尔茨海默病研究。

The expression of plasma microRNA-101a-3p in Alzheimer disease patients

DUAN Ran-Ran，PENG Tao，LI Yan-Fei，et al.
Department of Neurology，First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，Henan，China

【Abstract】Objective To investigate the expression of plasma microRNA(miR) -101a-3p in Alzheimer disease(AD) patients．Methods The subjects were divided into patient and healthy controls groups．MicroRNAs were extracted from plasma of cases and measured by gene microarray and real-time PCR．Results Gene microarray and real-time PCR showed that the expression level of miR-101a-3p in AD patients was significantly reduced compared to that of healthy people．Conclusions MiR-101a might be used as a diagnostic biomarkers in the early AD patients．

【Key words】Alzheimer disease; microRNA

阿尔茨海默病(AD)是一类病因未明的神经系统退行性疾病，目前临床上缺乏早期诊断的标准和有效的治疗措施。循环微小RNA(microRNA)是一种稳定存在于血浆、血清中的microRNA，其表达水平在肿瘤、糖尿病以及多种神经退行性疾病中存在特异变化〔1～3〕。同时，循环microRNA还具有不易降解、检测方法敏感、准确等特点〔4〕。这些都提示循环microRNA可以作为潜在生物标志物辅助相关疾病的诊断。本文通过检测AD患者与健康人血浆microRNA差异表达情况，试图寻找一种可能作为辅助诊断AD的早期生物标志物。

1　资料和方法

1.1研究对象选取2012年4月至2013年4月就诊于郑州大学第一附属医院神经内科门诊及病房的AD患者28例及同期住院的非AD健康老年人和部分体检中心的健康体检者共35例为研究对象。进行基因芯片检测的AD患者和对照组患者各5例，均为男2例，女3例，AD组患者年龄(64±2.3)岁，对照组为(64.4±2.81)岁。进行实时荧光定量PCR检测的AD患者23例，男12例，女11例，年龄(63.57±0.9)岁;对照组30例，男女各15例，年龄(65±0.98)岁。两组间人员的年龄、性别差异无统计学意义。见表1。

1.1.1病例组入选标准所有患者均进行临床检查、简易精神状态量表筛查(MMSE)，得分低于临界值(文盲≤17分、小学≤20分、初中及以上≤24分) ; Hachinski缺血指数量表≤4 分;患者无抑郁，汉米尔顿抑郁量表(17项版本)＜7分;并经过至少1名神经科医生诊断，符合美国国立神经病学、语言障碍和卒中-老年痴呆和相关疾病学会工作组(NINCDS-ADRAD)的“很可能是AD”的诊断标准。所有患者无阳性家族史。

排除标准:根据临床症状，病情进展特点和影像学检查，排除其他疾病引起的老年痴呆，如血管性痴呆、脑炎、脑外伤后遗症以及其他精神疾病。

1.1.2对照组入选标准与病例组年龄、性别、生活环境相似的非痴呆老年人，并对患者病史的详情及身体状况进行了解，排除了对照组患者抑郁、脑血管疾病及其他神经系统疾病的可能性;对照组患者无血液病、恶性肿瘤、严重的肝肾功能不全、感染疾病等其他疾病。

本实验得到郑州大学医学伦理委员会的承认与允许，所有标本的采集均获得入组人员的知情同意。

1.2方法

1.2.1血浆样本的收集及处理抽取每例受试者外周血于氟化钠/草酸钾管内，并在2 h内，于4℃、3 000 r/min离心10 min，留取上层血浆置于－80℃冰箱保存备用。

1.2.2血浆microRNA的提取按照miRcute miRNA提取分离试剂盒(北京天根公司DP501)说明书，采用吸附柱法提取血浆microRNA。

1.2.3microRNA芯片检测血浆miRNA表达水平将者血浆microRNA样本分别通过加poly(A)尾与一个寡聚核苷酸标记用于后续的荧光标记，然后在LC Sciences-μParafloTM微流体芯片上杂交过夜。在微流体芯片上，每条检测探针都是由一个化学修饰核苷酸编码段(与目标miRNA互补)和一个由聚乙二醇组成的间隔段组成。microRNA与探针杂交后，与标记特异结合的Cy3染料在微流体芯片上循环流动进行染色。最后利用激光扫描仪采集杂交图像并使用Array-Pro图像分析软件进行图像数字化转换。探针序列均来源于miRBase (http: / / www.mirbase.org/)，每张芯片可检测，共可检测2 042条人类microRNA(Sanger R19.0)。microRNA芯片检测试验由杭州联川公司完成。

1.2.4实时定量PCR验证芯片检测结果按照Reverse Transcription System (美国Promega公司A 3500)说明书，将microRNA逆转录为cDNA。按照GoTaq®qPCR Master Mix(美国Promega公司A6001)说明书进行荧光定量PCR，以5 s为内参。5 s、miR-101a-3p引物由武汉锐博公司提供。实时定量PCR检测在LightCycler 1.5仪器(瑞士Roche公司)进行。以2-ΔΔCt表示每个microRNA的相对表达量，每例样本重复检测3次，实验过程中采用盲法研究。

2　结果

2.1microRNA芯片检测结果通过芯片对5例AD患者和5例对照组血浆microRNA进行定量检测，结果提示，可筛选出68 个AD相关的差异表达microRNAs基因(P＜0.05) ; 27个AD患者血浆表达下调，41个表达上调。其中表达下调5倍以上基因的是miR-107、miR-29a、miR-29b、miR-15a、miR-19b、let-7i、miR-101a-3p、miR-106b、miR-22、miR-98、miR-30c;表达上调3倍以上的是miR-128、miR-146a、miR-26a、let-7b、miR-30e等。

以两组间microRNA表达量的差异倍数，即相对表达量(log2)的绝对值＞2.0且t检验P＜0.01为筛选标准，发现miR-101a-3p的表达水平在AD患者中显著低于对照组(log2= －5.53，P=1.19×10－5)。

2.2实时荧光定量PCR验证芯片检测结果通过实时荧光定量PCR方法对23例患者、30名健康对照的芯片检测结果进行验证，患者组中miR-101a-3p的相对表达量为8.834×10－4± 2.842×10－4，对照组为6.305×10－3±1.161×10－3。患者组表达量仅为对照组的14％，两组间差异显著(F= 21.76，P＜0.001)，结果与miRNA芯片检测结果一致。

2.3miR-101a-3p对AD的诊断效能ROC分析结果显示，通过miR-101a-3p的相对表达量对AD进行诊断时，曲线下面积(AUC)为0.872 5;如果以0.002 163为诊断临界值，即miR-101a-3p相对表达量低于0.002 163提示诊断AD，约登指数最大，为0.646 3;灵敏度和特异度均较高，分别为0.913和0.733。

3　讨论

本研究发现miR-101a-3p在AD患者血浆中表达水平显著低于健康人水平，并初步确定了通过miR-101a-3p辅助诊断AD的临界值。若以0.002 163为临界值，灵敏度和特异度均较高，但是考虑到本研究的样本量较小，该临界值的可行性及可重复性仍需进一步扩大样本量进行验证。

有研究表明miR-101能靶向作用于EZH2基因的3’端非翻译区参与基因沉默，又可以通过调控Mcl-1、Cox-2和Fos等癌基因或类癌基因影响肿瘤的发生与发展〔5，6〕。在AD方面的研究较少，尤其在循环血中miR-101的表达变化，而本实验利用microRNA芯片及实时荧光定量PCR技术弥补了这方面的空白。早期的研究表明〔7〕，在AD患者的脑组织内miR-101的表达是下调的。miR-101可能通过AD的三个发病机制影响AD病程的进展:①miR-101通过miRNA/RISC(RNA-induced silencing complex，RNA诱导的沉默复合体)途径降低淀粉样前体蛋白(APP)的表达水平，从而降低β淀粉样蛋白(Aβ)的水平〔8〕。②下调的miR-101导致环氧合酶-2(COX-2)的上调，从而促进炎症〔7〕。③miR-101的失调间接地有助于异常的tau蛋白磷酸化，从而促进神经营养因子(NTF)的增加〔9〕。有研究提示，循环microRNA是多种细胞通过出芽、胞吐等方式主动分泌并以外切体或者结合高密度脂蛋白形式稳定存在于血浆中的〔4〕。同时，还有研究显示血浆中的microRNA可以通过结合特异受体并以胞吞作用的方式再次进入细胞中，因此有学者认为循环microRNA可能像激素或细胞因子一样作为不同细胞间互相影响的中介物质〔10，11〕。结合本研究结果，在血液系统中循环miR-101a-3p可能间接反映脑组织内miR-101a-3p的表达变化，但AD患者血浆中miR-101a-3p表达水平下降的原因和机制尚需进一步研究。

综上所述，本研究结果显示miR-101a-3p在AD患者中的表达量显著降低，可能作为AD的一种潜在的生物标志物，但miR-101a-3p表达水平与AD的诊断是否具有特异性，尚需进一步扩大样本量进行验证，以明确不同程度认知功能障碍患者间的miR-101a-3p的表达量是否存在差异。

4　参考文献

1 Hebert LE，Weuve J，Scherr PA，et al.Alzheimer disease in the United States (2010-2050) estimated using the 2010 census〔J〕．Neurology，2013; 80(19) : 1778-83.

2 Junn E，Mouradian MM.MicroRNAs in neurodegenerative diseases and their therapeutic potential〔J〕．Pharmacol Ther，2012; 133(2) : 142.

3 Karolina DS，Tavintharan S，Armugam A，et al.Circulating miRNA profiles in patients with metabolic syndrome〔J〕．J Clin Endocrinol Metab，2012; 97(12) : E2271-6.

4 Mo MH，Chen L，Fu Y，et al.Cell-free Circulating miRNA biomarkers in cancer〔J〕．J Cancer，2012; 3(4) : 432-4.

5 Varambally S，Dhanasekaran S，Zhou M，et al.The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer〔J〕．Nature，2002; 419(6907) : 624-9.

6Wang H，Ruan H，He X，et al.MicroRNA-101 is down-regulated in gastric cancer and involved in cell migration and invasion〔J〕．Eur J Cancer，2010; 46(12) : 2295-303.

7 Long JM，Lahiri DK.MicroRNA-101 downregulates Alzheimer＇s amyloidbeta precursor protein levels in human cell cultures and is differentially expressed〔J〕．Biochem Biophys Res Commun，2011; 404(4) : 889-95.

8 Vilardo E，Barbato C，Ciotti M，et al.MicroRNA-101 regulates amyloid precursor protein expression in hippocampal neurons〔J〕．J Biol Chem，2010; 285 (24) : 18344-51.

9 Sachdeva M，Wu H，Ru P，et al.MicroRNA-101-mediated Akt activation and estrogen-independent growth〔J〕．Oncogene，2011; 30 (7) : 822-31.

10 Vickers K，Remaley A.Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication〔J〕．Curr Opin Lipidol，2012; 23 (2) : 91-71.

11 Duttagupta R，Jiang R，Gollub J，et al.Impact of cellular miRNAs on circulating miRNA biomarker signatures〔J〕．PLoS ONE，2011; 6(6) : e20769.

〔2014-08-16修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者:贾延劼(1971-)，男，主任医师，博士后，博士生导师，主要从事脑血管病及痴呆的研究。

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30770758，81071114)

〔中图分类号〕R749

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4421-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.002