王　黎　盛　巍　张群英

·检测诊断·

基于高通量技术在检测产褥期妇女阴道微生态的应用

王黎盛巍张群英

目的 采用高通量16S rDNA测序检测产褥期及正常妇女阴道微生态，以更好的了解妇女在产褥期的阴道微生态变化。方法 采集产褥期妇女（产后6～8周）及健康育龄妇女的阴道分泌物各5例，采用高通量技术检测其阴道微生物的种类。结果 阴道微生态菌种在产褥期和正常生育期差异显著，在正常妇女的阴道中，乳杆菌属占所有细菌含量的55%，而在产褥期妇女中，占22%。结论 产褥期妇女乳杆菌属所占比例明显低于正常生育期妇女，二代高通量测序技术有助于更清楚的了解阴道微生态群落的组成，以进一步了解产褥期妇女阴道微生态状况，探讨产褥期微生态特征，可以为生殖道健康干预、临床保健工作提供循证依据。

高通量技术 产褥期 阴道微生态菌群

女性阴道微生态体系是由阴道内的微生态菌群、机体的内分泌调节功能和解剖结构共同组成［1］。正常阴道内有多种微生物存在，而且这种微生物生态的形成对阻止一些泌尿生殖系统的疾病发生起着至关重要的作用。产褥期妇女作为特殊群体，其阴道微生态状况国内外研究较少，基于显微镜检查和传统的培养法而获得阴道微生物群落信息多样性具有严重偏差，阴道微生态的评价方法中非细胞培养的基因技术与细菌培养相比有无法比拟的优越性，为了更好的了解妇女在产褥期阴道微生态的变化，本资料通过采集产褥期妇女阴道分泌物，同时随机挑选正常育龄妇女的阴道分泌物，提取总DNA，扩增得到不同来源的微生物群落16S rDNA序列进行微生物种群分类、群落结构等初步分析。

1　临床资料

1.1一般资料 采集自2013年9月至2014年11月产褥期妇女（产后6～8周）阴道分泌物5例为观察组，并随机选取同时在本院健康体检育龄妇女的阴道分泌物5例为对照组。所有观察对象均用长棉签从阴道侧壁上1/3处取得阴道分泌物。观察组25～38岁，平均33.5岁。对照组年龄21～47岁，平均35岁。月经规律，1个月内无全身应用抗生素及阴道局部用药，3d内无性生活，并知情同意。纳入标准同时满足以下三项：⑴无临床症状。⑵阴道清洁度Ⅰ～Ⅲ。⑶Nugenf评分0～3分。

1.2方法 （1）检测：长棉签采集的微生物检测pH值、清洁度、脓球、滴虫、霉菌等。（2）DNA提取：长棉签采集的微生物悬浮于0.5ml灭菌的PBS溶液中，加入50μl溶菌酶，6μl溶菌素，3μl溶葡球菌酶和41μl TE50缓冲液，37℃消化1h，然后利用细菌基因组试剂盒提取DNA。（3）高通量16S rDNA测序及其数据分析：对细菌的V4区，利用Miseq进行测序，扩增引物为：F：5'-AYTGGGYDTAAAGNG-3'，R：5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'。扩增体系为50μl。扩增到目的条带后进行割胶回收，定量后，上机测序。测序所得结果根据不同的Barcode对序列的来源进行分类，采用Flash软件连接通过质量控制的序列对应的两端序列，舍弃无连接的序列。对连接上的序列进行过滤，获得最终序列。应用Qiime，根据序列的相似度，将序列归为多个OTU。Qiime调用uclust对序列进行聚类，选取每类最长的序列为代表序列。采用blast的方法对silva数据库进行比对，获得每个OTU分类学信息。得到每个OTU的分类学信息。OTU产出后，统计各个样品含有OTU情况及每个OTU中含有序列的数目。

2　结果

2.1阴道微生态状况 10例就诊者中，5例正常育龄妇女阴道微生态正常，5例产褥期妇女中1例外阴阴道假丝酵母菌病，1例为细菌性阴道病。正常育龄妇女组阴道分泌物pH值为（3.72±0.30），产褥期妇女组阴道分泌物pH值为（3.86±0.09），差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2测序情况统计 采用Flash软件，连接通过质量控制的序列对应的两端序列。舍弃无法连接的序列。对连接上的序列进行过滤（连续相同碱基＜6；模糊碱基N＜1），获得最终用于分析的序列。阴道微生态菌种在产褥期和正常生育期差异显著（P＜0.05）。应用Qiime，根据序列的相似度＞97%的归为一个OTU。根据OTU的数量和测序得到的序列数，做出每个样品的稀释曲线，从图中发现在产褥期妇女的阴道微生物的种数要明显多于正常生育期的妇女。为了进一步证明此种种数的差异是否能区分产褥期妇女和正常生育期的妇女，采用偏最小二乘方判别分析（PLS-DA）过滤与模型分类不相关信号即正交信号，获得PLS-DA模型，两组样本已经有较明显分离趋势。

2.3产褥期和正常生育期主要的差异菌 健康妇女阴道常驻菌包括乳杆菌、假丝酵母菌、B族链球菌等。结果发现，在正常妇女的阴道中，乳杆菌属占所有细菌含量的55%，而在产褥期妇女中，占22%。此次试验中主要鉴定到的乳杆菌属为Lactobacillus iners（正常人35%，产褥期0.8%），Lactobacillus crispatus（正常人8%，产褥期0.2%）和Lactobacillus fornicalis（正常人6%，产褥期0.07%）。

3　讨论

本资料采用测定16rsRNA方法对正常女性及产褥期女性的阴道菌群进行检测，进而全面、准确地获得阴道菌群的信息，结果显示，阴道微生态菌种在产褥期及正常生育期差异显著，其中产褥期妇女乳杆菌属所占比例明显低于正常生育期妇女。

阴道菌群非常复杂，常见菌种估计＞500 种，常规细菌培养法仅能检测10余种病菌，健康育龄女性阴道寄生菌以乳酸杆菌占绝对优势，本次采用宏基因组学方法测定正常生育期妇女阴道分泌物的检验，乳杆菌属占所有细菌含量的55%，有别于以往所说乳酸杆菌在此微生态系统中约占95%［2］，这要归功于宏基因组学在阴道微生态的研究应用。

随着近年来二代高通量测序技术的发展和完善［3］，测序价格亦大幅降低，同时，测序深度也明显增加，这有助于更清楚的了解阴道微生态群落的组成。与传统测序技术相比，新一代测序技术平台无论是测序原理、 测序过程、 适用范围，还是测序结果均存在本质上的不同，宏基因组学应用于阴道微生态，在国内尚属领先水平，其检验方法的应用可使检测定植于阴道微生物的种类更为全面、准确。但是，目前尚未广泛应用于临床，且本资料选择样本数量较少，故可能会影响产褥期微生物菌落的检测准确性，仍需进一步增加标本量进行研究，以进一步了解产褥期妇女阴道微生态状况，探讨产褥期微生态特征，可以为生殖道健康干预、临床保健工作提供循证依据。

1 李兰娟，主编.感染微生态学.北京：人民卫生出版社，2002，421～424.

2 张卓然.临床微生物学和微生物检验.第三版.北京：人民卫生出版社，2003.203～206.

3 盛桂莲，赖旭东，侯新东.古DNA实验体系及技术.中国生物化学与分子生物学报，2009，25（2）：116～125.

浙江省医药卫生科技计划项目（2012KYB202）

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