刘英杰，刘少奎，高新宇

· 论著 ·

厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀对血管损伤小鼠血管重构的干预研究

刘英杰，刘少奎，高新宇

目的观察厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀对血管损伤小鼠血管重构的影响。方法8周龄C57BL/6野生型雄性小鼠50只，随机分成5组：假手术组、手术组、厄贝沙坦治疗组（50 mg/kg·d）、瑞舒伐他汀治疗组（5 mg/kg·d）、厄贝沙坦（0.5 mg/kg·d）联合瑞舒伐他汀治疗组（2 mg/kg·d），每组10只。手术使用套管制作股动脉损伤模型。连续灌胃给药14 d后处死小鼠。留取小鼠股动脉标本，分别采用HE染色及NIH图像分析软件测量血管内膜面积，RT-PCR法检测MCP-1、CCR2及PPARγ mRNA表达水平。各组小鼠检测实验前后血脂及肝功能指标。结果假手术组（0μm2）未见血管内膜增生。新生内膜面积手术组（6497±5.7）μm2、厄贝沙坦治疗组（5979±1.4）μm2、瑞舒伐他汀治疗组（6005±5.8）μm2、厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组（2269±2.8）μm2，均有新生内膜形成，与假手术组比较有统计学差异（P均＜0.05）。与手术组比较，厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组新生内膜面积差异无统计学意义（P均＞0.05）。与手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组比较，厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组内膜增生面积降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。MCP-1 mRNA相对表达量：与假手术组比较，手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组、厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组相对表达量增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组比较，厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组相对表达量降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。CCR2 mRNA相对表达量：与假手术组比较，手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组、厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。PPARγ mRNA相对表达量：与假手术组比较，手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组、厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组相对表达量降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组比较，厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组相对表达量增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。MCP-1 mRNA相对表达量与PPARγ相对表达量呈负相关（r=-0.607，P＜0.05）。结论厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀可能通过增加PPARγ表达，降低MCP-1表达，延缓损伤血管的重构。

炎症信号通路；血管重构；单核细胞趋化蛋白1；过氧化物酶体增殖物活化受体γ；血管损伤；小鼠

血管重构广泛存在于整个血管损伤的应答过程中，并逐步蔓延至整个血管管壁。血管炎症在动脉粥样硬化中发挥着关键作用，对炎症的调控在预防及治疗心血管疾病方面有着重要作用。大量研究表明，MCP-1/CCR2信号通路作为介导血管壁炎症反应的主要信号通路，在血管重构中发挥着关键作用[1]。目前临床上应用的ARB类药物厄贝沙坦及他汀类药物瑞舒伐他汀均具有明显的抗血管炎症及抑制血管重构的作用[2-4]。本研究通过建立小鼠血管损伤模型，进一步观察瑞舒伐他汀联合厄贝沙坦对MCP-1/CCR2信号通路主要炎症因子单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、类趋化因子受体2（CCR2）及炎症抑制因子过氧化物酶体增殖体激活受体（PPAR-γ）表达的影响，以及对血管损伤后血管重构的干预作用。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂XP基因扩增仪（杭州博日科技有限公司）；OPMI7-D手术显微镜（德国蔡司公司）；VDS凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；NIH分析软件（大连理工大学生命学院实验室）；DY-300型低压电泳仪（广东省汕头市广播仪器厂）；德国BinderC150CO2孵箱（路易企业有限公司）；RNAiso Plus（Total RNA提取试剂，购自宝生物工程大连有限公司）；RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（宝生物工程大连有限公司）；瑞舒伐他汀（阿斯利康公司），厄贝沙坦（赛诺菲安万特公司）。

1.2 小鼠血管损伤模型制作及分组8周龄C57BL/6野生型雄性小鼠50只（购于大连医科大学实验动物中心），体重30～35 g，随机分成5组：假手术组、手术组、厄贝沙坦治疗组（50 mg/kg·d），瑞舒伐他汀治疗组（5 mg/kg·d）、厄贝沙坦（0.5 mg/kg·d）联合瑞舒伐他汀治疗组（2 mg/ kg·d），每组10只。小鼠腹部酒精消毒，1%戊比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后沿双侧腹股沟中点纵行切开皮肤，将双侧股动脉与周围组织分离，套上PE-50聚乙烯套管（内径0.56 mm；外径0.965 mm；美国Becton Dickinson公司产品，图1），以8-0号缝线捆绑固定。套管不阻碍股动脉血液流动。假手术组手术方法相同，但不放套管。术后给予乙酰螺旋霉素灌胃3 d，小鼠未发生死亡。造模后各组给予药物干预，灌胃给药14d，假手术组、手术组给予等容量生理盐水。14 d后处死50只小鼠，剪取约2 mm股动脉组织，每组取10条小鼠的股动脉，置于4%的多聚甲醛溶液中固定10 h后脱水石蜡包埋待用。同时留取一部分股动脉组织用于提取RNA。

1.3 股动脉HE染色股动脉两端和中部按5μm切片（每部分取3张切片观察），后HE染色。脱蜡→梯度酒精中水化→蒸馏水冲洗→苏木精染色2 min→自来水冲洗→1%盐酸－乙酸进行分化10 s→自来水冲洗→PBS液返蓝→自来水冲洗→伊红染色2 min→自来水缓慢冲洗→梯度酒精脱水→透明→中性树胶封片。光镜下进行HE染色切片的观测。新生内膜的面积采用NIH分析软件测量，每只小鼠的数据来自股动脉3个部分的平均值。

1.4 生化指标的检测各组于造模前及处死时采集鼠尾静脉血检测血脂和肝功能。采用脂酶法检测血脂，包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。采用速率法检测肝功能，包括谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）。

图1 股动脉损伤模型制作

1.5 小鼠股动脉MCP-1、CCR2、PPARγ mRNA表达的检测采用半定量RT-PCR法。于术后14 d处死小鼠，每组均取股动脉（2 mm）10条，提取10份总RNA。参照Total RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。小鼠MCP-1、CCR2、PPARγ基因引物序列，采用Gene bank数据库中的引物序列，由大连辰钰生化试剂经销公司合成。MCP-1正向引物序列：5' TTAAGGCATCACAGTCCGAG 3'；反向引物序列：5' TGAATGTGAAGTTGACCCGT 3'；产物片段：250 bp。CCR2正向引物序列：5' GAGGTCTCGGTTGGGTTGTA 3'；反向引物序列：5' CCACATAGGGATCATGACCC 3'；产物片段：247 bp。PPARγ正向引物序列：5' ATGGAAGACCACTCGCATT 3'；反向引物序列：5' AATCCTTGGCCCTCTGAGAT 3'；产物片段：130 bp。小鼠内参β-actin由宝生物工程有限公司根据上海闪晶分子生物科技有限公司设计的引物序列合成，其正向引物序列为5'GAGACCTTCAACACCCCAGC 3'；反向引物序列为5'CCACAGGATTCCATACCCAA 3'；产物片段：446 bp。所得总RNA按照PCR试剂盒说明反转录得到cDNA，将反转录所得到的10μl cDNA加入到40μl PCR反应液中，轻轻混匀按以下条件进行PCR反应。第一阶段：94℃×2 min 1个循环；第二阶段：94℃×30 s，56℃×30 s，72℃× 1 min，40个循环；第三阶段：72℃延伸10 min，扩增产物分别为247 bp、250 bp、130 bp、446 bp。各组样本反转录反应产物分为四份分别加入MCP-1、CCR2、PPARγ和内参β-actin的特异性引物进行PCR扩增反应。取MCP-1、CCR2、PPARγ和内参β-actin的扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳、溴乙锭染色，然后在凝胶图像分析系统上扫描分析，MCP-1、CCR2、PPARγ与内参β-actin的扩增片段的光密度比值为MCP-1、CCR2、PPARγ mRNA的相对表达量。

1.6 统计学方法应用 SPSS 20.0 统计软件进行统计分析处理，实验数据以均数±标准差（±s）表示，各组间比较采用完全随机设计单因素方差分析（one-way ANVOVA），多个样本均数间的两两比较采用SNK-q法，相关分析采用Spearman秩相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

图2 股动脉HE染色切片（×100），1.假手术组；2.手术组；3.厄贝沙坦治疗组；4.瑞舒伐他汀治疗组；5.厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组箭头指示内膜弹力层，黑色条=100μm

表1 股动脉MCP1、CCR2、PPARγ mRNA相对表达量变化及各组新生内膜面积

2.1 小鼠股动脉血管损伤模型建立情况小鼠股动脉HE染色结果显示：手术组及厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组、厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组有血管内膜过度增生，内膜弹力层外有新生内膜形成，新生内膜组织大量增生并向血管腔内突起；假手术组未见新生内膜形成，提示股动脉血管损伤模型造模成功。造模过程中，无小鼠死亡（图2）。

2.2 小鼠股动脉新生内膜面积比较假手术组（0μm2）未见血管内膜增生。新生内膜面积手术组（6497±5.7）μm2、厄贝沙坦治疗组（5979 ±1.4）μm2、瑞舒伐他汀治疗组（6005±5.8）μm2、厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组（2269± 2.8）μm2，均有新生内膜形成，与假手术组比较有统计学差异（P均＜0.05）。与手术组比较，厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组新生内膜面积差异无统计学意义（P均＞0.05）。与手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组比较，厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组内膜增生面积降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

2.3 股动脉MCP-1、CCR2、PPARγ mRNA相对表达量的变化MCP-1 mRNA相对表达量：与假手术组比较，手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组、厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组相对表达量增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组比较，厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组相对表达量降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。CCR2 mRNA相对表达量：与假手术组比较，手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组、厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。PPARγ mRNA相对表达量：与假手术组比较，手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组、厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组相对表达量降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组比较，厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组相对表达量增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

2.4 股动脉MCP-1 mRNA相对表达量与PPARγ相对表达量的相关性分析MCP-1 mRNA相对表达量与PPARγ相对表达量呈正态等级资料分布，但方差不齐，进一步作spearman秩相关分析，其相关系数为-0.607，有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 干预前后肝功能及血脂变化情况实验前各组肝功能及血脂水平比较，差异无统计学意义（P均＞0.05）；术后14 d，血脂、ALT、AST水平组间及实验前比较均无统计学差异（P＞0.05）。

3 讨论

大量研究表明，动脉血管的炎症改变，在动脉粥样硬化中发挥着关键作用，通过干预动脉血管炎症反应，改善血管重构，预防和减缓动脉粥样硬化发生，降低心脑血管疾病的发生率、死亡率以及血管成形术后的再狭窄率。

塑料微导管血管损伤模型可形成稳定的、可重复的内膜增生性病变，更好地反应血管重构期血管内膜的变化情况。据文献报道[5,6]，该模型一周后新生内膜开始增生，两周后增生程度达到最大。又因其制备时间短、可重复性强，故本研究选用了该模型。血管壁中最主要的炎症反应信号通路是MCP-1/CCR2信号通路，该信号通路包括多种炎症因子，如：MCP-1、CCR2、IL-1β、TNF-α等。MCP-1/CCR2信号通路在炎症介导的病理性血管重构中扮演着重要角色。在不同的动脉血管损伤模型中，抑制MCP-1/CCR2信号通路，可明显减少血管内膜增生，例如早期血管炎症反应所导致的单核细胞渗透、MCP-1蛋白表达增加、炎性细胞因子增加，导致后期新生内膜的形成[7]。抑制MCP-1/CCR2信号通路，在防止血管炎症及重构中发挥着重要的作用。过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR-γ）可以通过竞争性抑制炎症信号通路，同时下调粘附分子的表达，减少炎症细胞聚集，减少炎症介质生成，延缓动脉粥样硬化斑块的形成，以达到改善血管重构。为此，本研究采用半定量逆转录-聚合酶链反应，检测股动脉中MCP-1、CCR2、PPAR-γ的相对表达量，来反映股动脉中炎症反应的变化情况。

既往大量研究报道，血管紧张素II-1型受体参与了炎症损伤导致的血管重构，应用其受体抑制剂延缓血管重构。一项研究表明，厄贝沙坦与趋化因子受体2（CCR2）、单核细胞趋化蛋白1受体的亲和力明显强于其它ARB类药物，其降低单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达的能力也明显优于其他ARB类药物[8,9]。一些ARB类药物如：替米沙坦、厄贝沙坦，具有部分激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ的作用。

他汀类药物能够抑制动脉粥样硬化血管壁的MCP-1表达，也可以抑制MCP-1 /CCR2信号通路介导的单核细胞聚集[10,11]。Kleemann R等[12]发现瑞舒伐他汀对敲除APOE*3基因莱顿小鼠的血管壁中MCP-1、TNF-α炎症因子的表达有明显的抑制作用。Yano M等[13]研究表明，他汀类药物可以通过诱导环氧化物酶2（COX2），介导相关信号通路，激活PPAR-γ。最近的一项大型临床研究发现，瑞舒伐他汀显著降低健康人群主要心血管事件的发生率，这部分人群血脂正常，而高敏C-反应蛋白水平升高[14]。另一项研究也显示，以总斑块体积评估动脉粥样硬化疾病时，最大剂量的瑞舒伐他汀具有显著的消褪斑块的作用[15,16]。

综上，应用厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀能否强化抑制血管炎症作用，从而延缓血管重构，保护血管。为此本研究选用厄贝沙坦及瑞舒伐他汀，应用药物前后测定血脂及肝功能，了解该类药物的调脂作用及对肝功能的影响。

本研究结果显示各组小鼠实验前后血脂、肝功能均无明显改变。通过病理切片观察及新生内膜面积的统计，厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀可显著延缓血管内膜增厚，但并不能完全逆转血管重构。同时，联合用药降低了单药的剂量及不良反应。各治疗组CCR2 mRNA相对表达量均高于假手术组，但组间无明显差异。与手术组、厄贝沙坦治疗组、瑞舒伐他汀治疗组比较，厄贝沙坦联合瑞舒伐他汀治疗组MCP-1 mRNA相对表达量降低，PPARγ mRNA相对表达量增加。提示联合用药14 d后，损伤血管壁新生内膜过度增生降低，抗炎症作用增强，可能是通过升高PPAR-γ的表达，降低炎症因子MCP-1的表达，从而减轻炎症反应，延缓血管内皮损伤。但具体的细胞内信号传导机制尚未清楚，有待于进一步研究。

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Intervention of irbesartan combining rosuvastatin to vascular remodeling in mice with vascular injury

LIU Ying-jie*, LIU Shao-kui, GAO Xin-yu.*Institute of Electrocardiogram and Blood Pressure, Third People's Hospital of Chengdu City, Chengdu Second College of Clinical Medicine of Chongqing Medical University, Chengdu 610031, China. Corresponding author: LIU Ying-jie, E-mail: csahw2000@163.com

ObjectiveTo observe the influence of irbesartan combining rosuvastatin on vascular remodeling in mice with vascular injury.MethodsMale C57BL/6 wild mice (n=50, 8 weeks old) were randomly divided into sham-operation group, operation group, irbesartan group (50 mg/kg·d), rosuvastatin group (5 mg/kg·d), irbesartan (0.5 mg/kg·d)+rosuvastatin (2 mg/kg·d) group (each n=10). The model of femoral artery injury was established by using cannula. After 14-day intragastrical medication, the mice were executed and femoral samples were collected. The intima area was measured by using HE staining and NIH image analysis software, and expressions of MCP-1 mRNA, CCR2 mRNA and PPARγ mRNA were detected by using RT-PCR. The indexes of blood fat and liver function were detected in all groups before and after treatment.ResultsThere was no intima hyperplasia in sham-operation group (0 μm2). There were neointima formation in operation group (6497±5.7) μm2, irbesartan group (5979±1.4) μm2, rosuvastatin group (6005±5.8) μm2and irbesartan+rosuvastatin group (2269±2.8) μm2compared with sham-operation group (all P＜0.05). The difference in intima hyperplasia area had no statistical significance between operation group and irbesartan group or rosuvastatin group (all P＞0.05). The intima hyperplasia area decreased in irbesartan+rosuvastatin group compared with operation group, irbesartan group and rosuvastatin group (all P＜0.05). The expression of MCP-1 mRNA increased in operation group, irbesartan group, rosuvastatin group and irbesartan+rosuvastatin group compared with sham-operation group (all P＜0.05), and decreased in irbesartan+rosuvastatin group compared with operation group, irbesartan group and rosuvastatingroup (all P＜0.05). The expression of CCR2 mRNA increased in operation group, irbesartan group, rosuvastatin group and irbesartan+rosuvastatin group compared with sham-operation group (all P＜0.05). The expression of PPARγ mRNA decreased in operation group, irbesartan group, rosuvastatin group and irbesartan+rosuvastatin group compared with sham-operation group (all P＜0.05), and increased in irbesartan+rosuvastatin group compared with operation group, irbesartan group and rosuvastatin group (all P＜0.05). The expression of MCP-1 mRNA was negatively correlated to the expression of PPARγ mRNA (r=-0.607, P＜0.05). Conclusion Irbesartan combining rosuvastatin can reduce the expression of MCP-1 mRNA and delay remodeling of injured vessel through increase the expression of PPARγ mRNA.

Inflammatory signal pathway; Vascular remodeling; Monocyte chemoattractant protein-1; Peroxisome proliferator-activated receptor-γ; Vascular injury; mice

R543

A

1674-4055(2015)01-0072-05

2014-10-21）

（责任编辑：姚雪莉）

610031 成都,成都市第三人民医院 重庆医科大学附属成都第二临床学院 心电血压研究所

刘英杰,E-mail:csahw2000@163.com

10.3969/j.1674-4055.2015.01.23