陈礼娟 范如艳 范楚平 潘俊秀 肖志兵 刘 婵

南华大学附属郴州市医院 郴州市儿童哮喘防治技术研发中心，湖南省郴州市 423000

儿童哮喘支气管肺泡灌洗液成分分析＊

陈礼娟 范如艳 范楚平 潘俊秀 肖志兵 刘 婵

南华大学附属郴州市医院 郴州市儿童哮喘防治技术研发中心，湖南省郴州市 423000

目的：通过对儿童哮喘支气管肺泡灌洗液成分分析探讨其发病机制。方法：应用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法，对哮喘（29例）、支气管肺炎（26例）和对照组（20例）共75例患儿的支气管肺泡灌洗液进行细胞成分分析及上清液IgE、IL－12、IL－4、IL－13浓度测定。结果：哮喘组支气管肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞为3.3%（1.0%～9.0%），上皮细胞2.9%（0.5%～9.8%），IgE为（98.76±15.65）ngL，IL－4为（17.89±3.65）ngL，IL－13为（6.75±0.87）ngL，与支气管肺炎组和对照组相比明显增高，差异有非常显著意义（P＜0.01）；哮喘组IL－12为（2.12±0.76）ngL，与支气管肺炎组和对照组相比明显降低，差异有非常显著意义（P＜0.01）；支气管肺炎组中性粒细胞明显增多。结论：哮喘患儿支气管肺泡灌洗液以嗜酸性粒细胞和上皮细胞增多及IgE增高为其特征；哮喘患儿支气管肺泡灌洗液IL－4、IL－13浓度增高，IL－12浓度降低，提示Th1Th2失衡是哮喘重要发病机制；支气管肺泡灌洗液检查可为哮喘患儿诊断提供有益线索。

儿童 哮喘 支气管肺泡灌洗液 粒细胞 IgE 白介素

支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞成分及细胞因子分析能对气道炎症反应进行直观反映，揭示哮喘发病机制，丰富人们对哮喘的认识。本研究应用BALF检查技术，对临床上常见的儿童哮喘及支气管肺炎患儿进行了相关炎性细胞及炎症介质的分析，探讨BALF检查技术在儿童哮喘诊疗中的应用及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2012－2014年本院住院患儿，共75例，将其分成3组：（1）哮喘组：共29例，均为哮喘缓解期患儿，除外其他系统合并症及并发症患儿，除外长期或规律应用激素史者。其中男16例，女13例；年龄5～10岁，平均年龄（5.83±2.75）岁；病程5～28d，中位病程7d。诊断依据中华医学会儿科分会呼吸学组颁布的标准[1，2]。（2）支气管肺炎组（肺炎组）：共26例，均为普通支气管肺炎患儿，除外重症肺炎和其他系统合并症及并发症患儿。其中男15例，女11例；年龄3～10岁，平均年龄（5.50 ±3.25）岁；病程4～24d，平均病程7d。诊断依据中华医学会儿科分会呼吸学组颁布的标准[3]。（3）对照组：共20例，均为支气管异物取出术后1周复查纤维支气管镜术患儿，均选取健侧行支气管肺泡灌洗，除外临床或纤维支气管镜下有炎症表现患儿。其中男11例，女9例；年龄2～6岁，平均年龄（3.33 ±2.25）岁；病程2～26d，中位病程5d。所有患儿均获家长知情同意并签订纤支镜术及支气管肺泡灌洗术同意书后行纤维支气管镜术及支气管肺泡灌洗术。三组在年龄构成、性别以及病程之间差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本采集[4～7]：所有患儿均术前检查心电图、凝血功能、术前抗体、肝炎全套、心电图、凝血功能正常方能进行纤支镜下肺泡灌洗，术前30min雾化吸入可比特1.25ml（异丙托溴铵0.25mg，沙丁胺醇1.5mg）和2%利多卡因2ml，以减少气道分泌、痉挛和达到气道局部麻醉，术前10min静脉推注咪达唑仑0.15～0.30mgkg镇静，手术均在持续低流量吸氧和心电监护下进行，选用合适镜条，采用经鼻腔插入法，进入声门、气管时予2%利多卡因2～5ml经活检孔注入以达到气道局部麻醉和减少气道痉挛，在右中叶或左舌叶开口处以37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗（体重小于20kg者，每次灌洗量1mlkg，共3次；体重大于20kg者，每次灌洗量20ml，使灌洗总量达3mlkg），并立即以13.3～20kPa（100～150mmHg）负压进行抽吸。第一次灌洗所得BALF送检病原学培养，其余混匀，4℃保存，30min内送检。回收率大于40%、无大气道分泌物混入、红细胞小于20%的标本视为合格标本。每份标本均以4℃1 500rmin离心10min，其沉渣用于细胞分析，上清液置于－70℃保存，待检。

1.2.2 细胞计数[8，9]：细胞活力以台蓝染色排除法评判；计细胞总数尿沉渣分析仪，结果以×106ml表示；分类计数细胞涂片的制备采用离心涂片法，以瑞氏－姬姆萨染色法染色，每张涂片计数200个细胞，取2张涂片的平均值。

1.2.3 BALF上清液IgE、IL－12、IL－4、IL－13浓度测定：用ELISA法检测BALF上清液IgE、IL－12、IL－4、IL－13浓度，试剂盒为R&D公司生产，检测结果单位为ngL。

2 结果

2.1 BALF细胞总数及分类计数 哮喘组和肺炎组细胞总数高于对照组（P＜0.01），提示气道具炎症反应。三组间巨细胞淋巴细胞差异无显著意义。中性粒细胞肺炎组高于对照组和哮喘组（P＜0.01），提示其气道存在感染。哮喘组嗜酸性粒细胞及上皮细胞高于对照组及肺炎组（P＜0.01）。提示哮喘组气道存在致敏状态，气道黏膜上皮细胞脱落。见表1。

表1 各组BALF细胞总数及分类计数（中位数及范围）

2.2 BALF上清液IgE、IL－12、IL－4、IL－13浓度比较 哮喘组IgE高于肺炎组和对照组（P＜0.01），提示哮喘为IgE介导的炎症反应。哮喘组IL－4、IL－13高于肺炎组和对照组（P＜0.01），哮喘组IL－12低于肺炎组和对照组（P＜0.01），提示哮喘儿童Th1Th2细胞失衡。见表2。

表2 各组BALF上清液IgE、IL－12、IL－4、IL－13浓度比较（±s，ngL）

表2 各组BALF上清液IgE、IL－12、IL－4、IL－13浓度比较（±s，ngL）

注：a与对照组比较，P＜0.01；b与肺炎组比较，P＜0.01。

IL－13对照组20 27.23±8.47 4.27±0.84 4.25±1.38 3.09±0.69组别n IgE IL－12IL－4肺炎组26 32.53±9.52 5.31±0.53 5.35±1.21 3.52±0.83哮喘组29 98.76±15.65ab2.12±0.76ab17.89±3.65ab6.75±0.87abF 321.156 221.468 321.042 334.283 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 讨论

本研究应用儿童BALF检查技术，对临床上常见的儿童哮喘及支气管肺炎患儿进行了相关炎性细胞及炎症介质的分析，探讨BALF检查技术在儿童哮喘诊疗中的应用及意义。

气道慢性炎症是各型各期儿童哮喘共同的病理学特征，表现为嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润和上皮损伤，嗜酸性粒细胞是强效的炎前细胞，活化IL－5可使之增殖和活化，并释放更多的细胞因子和炎症介质，从而导致气道黏膜上皮受损和气道高反应性。近年国内有作者报道哮喘患儿BALF的研究结果[10，11]，本研究支持这一观点，提示哮喘患儿BALF中嗜酸性粒细胞及上皮细胞明显增多为其气道炎症的特征性改变。

哮喘患儿血清特异性IgE的水平与疾病程度、临床表现密切相关，是哮喘发病的关键因子，IgE介导Ⅰ型变态反应导致了哮喘急性发作[12]。本研究哮喘患儿BALF中IgE升高，提示哮喘患儿气道内分泌物IgE增高。哮喘的病因和发病机理相当复杂，目前认为是一种由多种炎症细胞、炎性介质和细胞因子参与的气道慢性炎症性疾病，其中Th1Th2型细胞因子在支气管哮喘病理生理过程中起重要的作用[11]。哮喘患儿Th1细胞减少，而Th2升高。IL－4、IL－13主要由活化的Th2细胞分泌，影响T淋巴细胞的分化及B淋巴细胞抗体分泌，参与哮喘呼吸道炎症形成，是哮喘发病的重要因素[13～15]。IL－12主要由活化的Th1细胞分泌，对哮喘具有保护作用，抑制呼吸道抑制反应[16]。本研究哮喘患儿BALF中IL－4、IL－13升高，IL－12降低，提示Th1Th2型细胞因子存在不平衡是儿童哮喘慢性气道炎症形成的主要原因。

综上所述，哮喘患儿BALF中嗜酸性粒细胞及上皮细胞明显增多，IgE增高，为其气道炎症的特征性改变；Th1Th2失衡导致IL－4、IL－13升高IL－12降低是哮喘重要发病机制；BALF检查可为哮喘患儿诊断提供有益线索。

[1] 中华医学会儿科学会呼吸学组.儿童支气管哮喘诊断与防治指南〔J〕.中华儿科杂志，2008，46（10）：745－753.

[2] 鲁继荣，乔红梅.儿童哮喘诊断与治疗指南－2007年版美国儿童哮喘诊断与管理指南解读〔J〕.实用儿科临床杂志，2010，25（4）：306－308.

[3] 中华医学会儿科学会呼吸学组，《中华儿科杂志》编辑委员会.儿童社区获得性肺炎管理指南（试行）（上）〔J〕.中华儿科杂志，2007，45（2）：83－90.

[4] 胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学〔M〕.第7版.北京：人民卫生出版社，2010：242－243.

[5] 刘长庭.纤维支气管镜诊断治疗学〔M〕.第2版.北京：北京大学医学出版社，2010：181－185.

[6] 刘玺诚.纤维支气管镜及临床应用〔J〕.中国实用儿科杂志，2009，14（4）：209－210.

[7] 中华医学会儿科学会呼吸学组儿科支气管镜协作组.儿科支气管镜术指南（2009年版）〔J〕.中华儿科杂志，2009，47（10）：740－744.

[8] 叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规范〔M〕.第3版.北京：中华人民共和国卫生部医政司，2006：744－745.

[9] 许健，周道银，俞靖龙，等.支气管肺泡灌洗常规细胞形态学检查的临床应用价值评价〔J〕.检验医学，2012，27（3）：221－224.

[10] 张翠翠，温明春，杜秀伟，等.难治性哮喘患儿支气管肺泡灌洗细胞分类及病原学分析〔J〕.中华哮喘杂志：电子版，2013，7（3）：15－18.

[11] 张建华，陈凌.支气管哮喘的免疫治疗〔J〕.中华儿科杂志，2013，28（16）：1203－1206.

[12] Mauro M，Incorvaia C，Formigoni C，et al.The anti－IgE antibody onalizumab as a probe to in－Vestigate the role of IgE in pathology〔J〕.Panminerva Med，2012，54（4）：305－312.

[13] Wenzel S，Wilbraham D，Fuller R，et al.Effect of an interleukin－4variant on late phase Asthmatic response to allergen challenge in asthmatic patients：results of two phase 2astudies〔J〕.Lancet，2007，370（9596）：1422－1431.

[14] Robinson DS.Mepolizumab treatment for asthama〔J〕.Expert Opin boil Ther，2013，13（2）：295－302.

[15] Hacha J，Tomlinson K，Maertens L，et al.Nebulized anti－IL－13monoclonal antibody Fab’f－Ragment reduces allergen－induced asthma〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol，2012，47（5）：709－717.

[16] Ke X，Huang J，Chen Q，et al.Protetive effects of combined Mycobacterium bovis BCG and Interleukin－12vaccination on airway inflammation in a murine model of allergic asthm〔J〕.Clin Invest Med，2010，33（3）：E196－E202.

The Components Analysis of Bronchoalveolar Lavage Fluid of Pediatric Asthma Patients

CHEN Lijuan，FAN Ruyan，FAN Chuping，et al.Chenzhou Affiliated Hospital of the University of South China，Development and Investigation Center of Prevention and Control Technology of Pediatric Asthma of Chenzhou City，Hu’nan Province 423000

Objective：To explore the pathogenesis of pediatric asthma，we analyzed the pediatric asthma bronchoalveolar lavage fluid including cell composition and cytokine level.Methods：Using ELISA，we measured IgE，IL－12，IL－4and IL－13and counting the cell number in bronchoalveolar lavage fluid of 75patients including asthma（n＝29），bronchopneumonia（n＝26），control（n＝20）.Results：In the group of asthma，eosnophils was 3.3%（1.0%～9.0%），epithelial cell 2.9%（0.5%～9.8%），IgE was（98.76±15.65）ngL，IL－4was（17.89±3.65）ngL，IL－13was（6.75±0.87）ngL.That was significantly higher than the group of bronchopneumonia and control（P＜0.01）.IL－12（2.12±0.76）ngL in the group of asthma was significantly lower than the group of bronchopneumonia and control（P＜0.01）.However，neutrophil was obviously increased in the bronchopneumonia.Conclusion：Pediatric asthma bronchoalveolar lavage fluid was characterized with the increase of eosnophils，epithelial cell and IgE.The concentration of IL－4and IL－13increased，but the concentration of IL－12decreased in the bronchoalveolar lavage fluid of pediatric asthma.It is suggested that the unbalance of Th1Th2is of importance in the pathogenesis of pediatric asthma.

Children，Asthma，Bronchoalveolar lavage fluid，Granulocyte，IgE，Interleukin

R725.6

A

1001－7585（2015）12－1554－03

2015－02－06

（编辑羽飞）

郴州市科技局资助重点项目（2012cj084.CZ2013065）。通讯作者：范楚平