曹伟宇，王鹏远，冯 斌，王晓娟

军事口腔医学国家重点实验室 第四军医大学口腔医院药剂科，西安 710032

九节龙(Ardisia pusilla A.DC.)系紫金牛科紫金牛属植物，主要含三萜皂苷类成分，九节龙皂苷I(Ardipusilloside I，ADS I)(图1)［1］是从该全草中提取出来的三萜皂苷，体外细胞试验表明，九节龙皂苷I 对肝癌、胃癌、卵巢癌、肺癌等8 种人癌细胞均有良好的抑制活性［2］。体内动物实验表明，荷瘤动物经ADS I 灌胃后对小鼠肉瘤(S37、S180)、Lewis 肺癌及裸鼠肝癌SMMC-7721 等实体瘤均有显著的抑制作用［3-6］。而ADS I 药代动力学研究显示，ADS I本身几乎不能被大鼠肠道吸收，其可能在大鼠肠道菌群作用下转化为新的物质，进入大鼠体内循环的成分经质谱全扫描初步推测为ADS I 的系列脱糖代谢产物［7］，而这些产物可能才是对荷瘤动物模型发挥抗肿瘤作用的物质基础。ADS I 是三萜皂苷，有溶血性，无法通过静脉给药，而口服给药，肠道吸收差，生物利用度低，这已成为ADS I 等皂苷类新药研发的瓶颈。皂苷经口服到达靶器官起作用的活性物质，很大一部分是经肠道菌群生物转化后的活性代谢产物，因此从皂苷的代谢产物中寻找活性更强、药动学性质更好的抗肿瘤活性成分是突破上述瓶颈的重要手段之一［8，9］。有文献报道，人参皂苷(如Rg1、Rc、Rg3)等多种天然皂苷均可被人肠道菌转化，产生的代谢物对肿瘤细胞具有抑制作用［10-12］。本实验通过研究ADS I 与离体培养人肠道菌群作用，经提取分离纯化过程，应用HPLC-ELSD 和UHPLC-ESIMS/MS 技术分析推断其可能代谢产物结构，拟阐明ADS I 经人肠道菌代谢的可能途径，比较ADS I 在人与大鼠肠道的代谢差异，进而寻找ADS I 发挥抗肿瘤作用的体内物质基础，为其临床研究提供依据。

图1 ADS I 化学结构式Fig.1 Chemical structure of ADS I

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20A 高效液相色谱仪(日本岛津科技公司);Alltech 3300 型蒸发光散射检测器(美国Grace公司);1290 Infinity 超高效液相色谱(UHPLC)-6460型三重串联四极杆液质联用仪，配有电喷雾离子源(ESI)及Mass Hunter 工作软件(美国Agilent 科技公司);BT125D 电子天平(德国Sartorius 公司)，MLS-3180 型高压蒸汽灭菌器(日本三洋公司)，A85 厌氧培养工作站(英国Don Whitley Scientific 公司)，Analytic 超纯水仪(英国ELGA 公司);旋转蒸发仪(上海申生有限公司)。

1.2 材料与试剂

普通厌氧培养基(GAM)购于青岛高科园海博生物技术有限公司，ADS I(实验室自制，纯度＞95%)［13］，甲醇、乙腈为色谱纯(美国Fisher 公司)，其它均为分析纯。

2 实验方法

2.1 HPLC-ELSD 条件

色谱柱:Diamonsil C18(2)(4.6×250 mm，5μm)(北京迪马科技公司);流动相:甲醇(A)-水(B)梯度洗脱，0～12 min，75%A，12～30 min，75%～90%A，进样量10 μL，流速1 mL/min，柱温25 ℃;ELSD:漂移管温度60 ℃，气体流速2.0 L/min，增益1。

2.2 UHPLC-MS 条件

色谱柱:Poroshell 120 EC-C18柱(2.1×100 mm，2.7 μm)(美国Agilent 科技公司)，流动相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脱，0～15 min 35%A，15～16 min 35～50%A，16～30 min 50%A，进样量:2 μL，流速:0.4 mL/min，柱温:25 ℃。离子源类型:ESI，检测模式:负离子模式，干燥气:N2，干燥气温度:350 ℃，干燥气流速:10 L/min，毛细管电压:-3500 V，碎裂器电压:380 V，雾化器压力:45 psi，鞘气温度:350 ℃，鞘气流速:11 L/min，质量扫描范围:m/z 100～1200。

2.3 厌氧培养液的配制

取厌氧培养基约9.5 g 置烧杯中，加适量纯水，水浴中搅拌使溶解，冷却后转移并定容至1000 mL量瓶中，NaOH 调pH 到7.0～7.5，即得GAM 培养液，0.07 MPa 115 ℃高压灭菌20 min，冷却后备用。

2.4 人肠道菌培养液的配制［14，15］

取新鲜健康志愿者的粪便10 g，加入300 mL 厌氧培养液，用玻璃棒打碎、搅拌均匀，多层纱布过滤3 次，即得人肠道菌培养液。

2.5 ADS I 在人肠道菌培养液中的代谢

称取4 份ADS I 粉末各约10 mg，置50 mL 无菌离心管中，先用100～200 μL 甲醇溶解，再加入50 mL 厌氧培养液，振摇使其充分溶解，另取不加ADS I 的人肠道菌培养液作为空白对照。所有样品均放入厌氧培养系统中，37 ℃恒温密闭培养8、24、48、72 h，按照时间点取出各样品。将样品用50 mL 水饱和的正丁醇:乙酸乙酯(1∶1)混合溶剂萃取3 次，合并上层萃取液，旋转蒸发仪75 ℃减压浓缩，经水浴蒸干后其残渣用甲醇复溶，按照上述HPLC-ELSD 和UHPLC-MS 条件分别进行分析，记录色谱图和质谱图。

3 实验结果

3.1 HPLC-ELSD 分析

通过对ADS I 的人肠道菌培养物进行检测后发现，相对于空白培养液，随着培养时间延长，ADS I逐渐转化产生代谢产物M1、M2 和M4。8～24 h 时，只检测到M1，其含量逐渐升高，48 h 时M1 含量达到最高，同时检测到M2，72 h 时，M1 相对减少，M2相对增加，同时新检测到M4(见图2)。

初步推断厌氧培养条件下ADS I 经人肠道菌代谢后产生了新的物质，根据保留时间推断这些代谢物的极性均小于ADS I，这一结果符合三萜皂苷类物质在肠道菌以脱糖代谢方式转化为比原药极性小的次生苷或苷元的规律，且结果显示ADS I 在人肠道菌中代谢48 h 后再无新的代谢物产生，代谢72 h后各代谢物的含量几乎趋于平衡。

图2 ADS I 与人肠道菌培养后的HPLC-ELSD 色谱图Fig.2 HPLC-ELSD chromatograms of ADS I incubated with human intestinal bacteria

3.2 UHPLC-ESI-MS/MS 分析

根据文献报道，串联四级杆质谱通过适度调节破碎电压(Fragmentor voltage)可以获得相对丰富的碎片离子［16，17］。本实验采用较高的破碎电压(F=380V)的策略对ADS I 及代谢物在负离子模式下进行全扫描，得益于质谱的高灵敏度，发现培养48 h后的样品能检测出HPLC-ELSD 未检出的新代谢物M3，培养72 h 的样品中四种代谢物的含量趋于平衡，其提取离子流图及全扫描质谱图见图3。根据准分子离子峰推算出代谢物的分子量，通过适当增大破碎电压和碰撞能量进行子离子扫描使其产生更多的碎片离子，再根据ADS I 的质谱裂解规律及获取的多级质谱碎片离子信息对代谢物的结构进行推断，各化合物的保留时间、分子质量、多级质谱碎片信息等数据见表1。

图3 ADS I 人肠道菌培养72h 的提取离子流图及代谢物全扫描质谱图Fig.3 Selected ion chromatogram of the extract of ADS I and human intestinal bacteria and full-scan mass spectra of the metabolites

表1 ADS I 及代谢产物的色谱和质谱数据Table 1 Retention time，possible formula and MS data of ADS I and its metabolites

本实验在电喷雾负离子模式下进行全扫描得到ADS I 及其代谢物M1～M4 的准分子离子峰［MH］-m/z1073、911、765、603、471，结合ADS I 的化学结构，可以初步推断M1～M4 可能为ADS I 的脱糖基产物。为进一步研究系列代谢产物的结构，通过调整质谱碎裂电压和碰撞能量获得更多特征碎片离子信息，ADS I 的［M-H］-离子(m/z 1073)可产生碎片离子m/z 927、765、603，再以m/z 927 为母离子进行MS2分析产生碎片离子m/z 765、603、471。代谢物M1 的［M-H］-离子(m/z 911)相对ADS I 少了162Da，MS2分析也产生m/z 765、603、471 等碎片离子，故可推断M1 是ADS I 代谢脱去末端一分子葡萄糖的化合物。代谢物M2 的［M-H］-离子(m/z 765)相对M1 少了146 Da，可产生碎片离子m/z 603、471，由上文HPLC-ELSD 检测结果推断M2 可能是由M1 转化而来，故可推测M2 是M1 脱一分子鼠李糖得到的化合物，同理可推断M3 是在M2 基础上脱去1 分子葡萄糖的产物，M4 是在M3 基础上再脱去一分子阿拉伯糖的产物。与已报道文献不同的是［7］，ADS I 经人肠道菌的代谢产物和经大鼠肠道菌的代谢产物不尽相同，质谱分析结果表明，ADS I经大鼠肠道菌群作用后产生特有的化合物X1，而人肠道菌群作用后检测到特有的化合物X2，即代谢产物M3，二者推测结构见图4。ADS I 及其代谢产物的可能质谱裂解途径见图5。

4 讨论与结论

图4 ADS I 经人和大鼠肠道菌转化产生的特有代谢产物可能结构(X1 大鼠，X2 人)Fig.4 The possible structures of specific metabolites of ADS I transformed by human and rat intestinal bacteria(X1 rat，X2 human)

图5 ADS I 及代谢物可能裂解途径Fig.5 The possible fragmentation pathway of ADS I and its metabolites

本实验通过体外模拟人肠道菌群对ADS I 的生物转化作用，利用HPLC-ELSD 和UHPLC-ESI-MS/MS 技术对其代谢产物进行检测分析，采用灵活调整破碎电压和碰撞能量的策略让串联质谱产生更丰富的碎片离子信息，首次对ADS I 的离体人肠道菌代谢物进行质谱裂解规律解析，初步推断出M1、M2、M3、M4 四种代谢产物的结构。其中代谢产物M1、M2、M4 与ADS I 在大鼠肠道代谢的产物相同，均为ADS I 分别脱去c 糖、(c+d)糖及(a+b+c+d)糖后形成的次生苷及苷元［7］。值得注意的是，ADS I经大鼠肠道菌群作用后产生特有的脱去了d 糖的化合物X1，而经人肠道菌群作用后形成特有的脱去了(b+c+d)糖的化合物X2(即M3，二者可能结构见图4)，暗示由于人和动物肠道菌群的组成差异，ADS I 的肠道菌转化产物不尽相同，代谢规律各异，该结果为ADS I 在人肠道内的转化吸收研究和进一步临床研究提供了参考。

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