傅春燕，刘永辉，杨 林，陈 波

1 邵阳医学高等专科学校;2 湖南省新邵县红十字会医院，邵阳 422000;3湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验室，长沙 410081

瓜馥木［Fissistigma oldhamii(Hemsl.)Merr.］，又名铁牛钻石、钻山风、香藤，为番荔枝科(Annonaceae)馥木属(Fissistigma griffi.)植物，是广西药材“十八钻”中的“铁钻”。根和藤茎入药，性温味辛，具有祛风除湿、活血止痛等功效，用于跌打损伤、关节炎、腰痛、胃痛及坐骨神痛的治疗［1］。瓜馥木中富含黄酮类化合物、生物碱等活性成分［2］。黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性［3］，天然来源黄酮类成分还具有广泛抗抑郁活性［4-7］。在前期研究中，本课题组对瓜馥木总黄酮的最佳提取工艺进行了研究，并报道了瓜馥木富集纯化的总黄酮部位具有较强的清除自由基能力［8］。在此基础上，本实验以瓜馥木总黄酮为研究对象，首次报道筛选了5种大孔树脂分离纯化瓜馥木总黄酮的工艺，并进行了总黄酮抗抑郁活性的测试，为进一步研究瓜馥木黄酮类化合物奠定理论基础，为开发新结构及新作用的高效低毒抗抑郁剂提供新的思路。

1 材料与仪器

瓜馥木药材2011 年8 月采自广西临桂，由广西师范大学生命科学院唐绍清教授鉴定为瓜馥木藤茎［F.oldhamii(Hemsl.)Merr.］。芦丁对照品(纯度≥98%，HPLC，批号:080-9303)，中国药品生物制品检定所提供;其他试剂均为市售分析纯。电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司);TU-1901 双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);KQ-500E 型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);AB-8、HPD-600、HPD-826、X-5 和D4006 型大孔吸附树脂购自天津南开大学化工厂。雄性ICR 小鼠，5周龄，体重20～22 g，由湖南农业大学动物医学院提供［生产许可证号:SCXK(湘)2013-0004］。

2 实验方法

2.1 大孔树脂预处理

选择五种大孔吸附树脂作为考察对象，分别为:AB-8、HPD-600、HPD-826、X-5 和 D4006。按 文献［9-11］报道预处理方法:各种型号树脂用95%乙醇浸泡12 h 后，湿法装柱，用95%乙醇4 BV 动态清洗，再用水洗至无醇味;依次用5%盐酸(浸泡3 h后，3 BV 清洗，水洗至中性)和5% NaOH(浸泡3 h后，3 BV 清洗，然后水洗至中性)处理;最后用95%乙醇清洗至乙醇洗脱液与水混合(1∶5)不呈白色混浊为止;用水洗至无醇味，备用。

2.2 上样液制备

将瓜馥木藤茎于60 ℃干燥烘干，粉碎，过60目。精密称取一定量瓜馥木药材粉末，按本课题组的工艺提取(即提取时间3 h，乙醇浓度90%，固液比1∶10，提取温度为70 ℃)［8］，趁热过滤，减压回收溶剂至无醇味，残留物加药材10 倍量水超声分散，离心，即得浓度1.0 g 生药材/mL 的上样液，备用。

2.3 考察指标

树脂的吸附量是评价树脂性能的一项重要指标［12］。以树脂对总黄酮的吸附量、吸附-解吸率以及洗脱物中总黄酮的含量作为考察指标，优选纯化瓜馥木总黄酮的最佳树脂。

2.3.1 动态吸附量考察

取5 种不同型号大孔树脂(AB-8、X-5、D4006、HPD-826、HPD-600)各20 mL，装入色谱柱，测定死体积后，将浓度为1.0 g 生药材/mL 样品液分别通过树脂柱，以1.0 mL/min 流速进行动态吸附，流出液每10 mL 收集1 份，用HCl-Mg 反应检测，待显色反应呈明显阳性时，停止上样，记录上样量，并计算总黄酮吸附量。

2.3.2 吸附-解析率测定

取“2.3.1 动态吸附量测定”项下树脂柱用蒸馏水清洗除杂，50%乙醇洗脱至无色。收集50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，称重。取50%乙醇洗脱物适量，按瓜馥木总黄酮含量测定方法［8］分别测定洗脱物中总黄酮含量，计算吸附-解析率［13-15］。

2.4 试验设计

选择大孔树脂的吸附条件优化(吸附浓度、吸附流速、树脂床径高比、泄漏曲线)、除杂条件优化(除杂溶剂、除杂体积)和洗脱条件优化(洗脱剂、洗脱流速、洗脱曲线)几个单因素水平分析来考察瓜馥木总黄酮最佳纯化工艺，最后采用工艺验证试验确定最佳纯化工艺条件。

2.5 瓜馥木总黄酮抗抑郁作用的研究

将小鼠60 只随机分为五组，分别为空白对照组，阳性药盐酸氟西汀胶囊5 mg/kg 给药组，瓜馥木总黄酮50、100、150 mg/kg 三个剂量给药组，每天给药一次，连续给药10 d，空白对照组同时给以同体积的1%羧甲基纤维素钠水溶液20 mL/kg。末次给药后1 h，开始检测。

2.5.1 小鼠强迫游泳试验

根据Porsolt 建立的方法［16］，加以改进。末次给药后1 h，将小鼠分别置于温度25±1 ℃、深度10 cm 的水中强迫游泳6 min。先适应2 min，记录后4 min 内小鼠累计不动时间。判定不动的标准是动物在水中停止挣扎，呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面。

2.5.2 小鼠悬尾试验

根据Lucien Steru 等建立的方法［17］，加以改进。末次给药后1 h，分别将小鼠尾部2 cm 处的部分固定于自制的悬尾支架上，使小鼠呈倒挂状态，其头部离台面约5 cm，每只动物两侧用板隔开，遮挡动物视线，使之互相不干扰。观察各组动物在6 min 之内后5 min 的累计不动时间。判定不动的标准是动物在停止挣扎，身体呈垂直倒悬状态，静止不动。

2.5.3 小鼠自主运动实验

使用小鼠自由活动计时器，仪器分为4 个直径15 cm 的圆柱形暗室，小鼠给药30 min 后，每个暗室放1 只，仪器自动记录5 min 内小鼠自主运动情况。动物给药方法与剂量均与活性实验一致。

2.6 统计学方法

每组样本以均数±标准差表示，采用单因素方差分析比较各组间的差异，然后用GraphPad Software(Version 4.0)进行统计学分析。

3 结果与分析

3.1 指标考察

动态吸附量考察和吸附-解析率测定结果见表1。

表1 不同树脂动态吸附量、吸附-解析率、含量测定结果Table 1 Results of dynamic adsorption quantity，adsorption-desorption and content with different resins

由总黄酮吸附量、吸附-解析率、含量可知，AB-8型树脂明显优于其他树脂，故选择AB-8 型大孔吸附树脂作为瓜馥木总黄酮纯化工艺用树脂。

3.2 AB-8 型大孔吸附树脂纯化工艺优化

3.2.1 吸附条件优化

3.2.1.1 吸附浓度考察

对上述瓜馥木的提取液减压回收溶剂至无醇味，残留物加水超声分散，离心，配制成表2 所述各浓度上样液，分别通过AB-8 型大孔吸附树脂柱(树脂体积20 mL)，吸附流速1.0 mL/min，进行动态吸附。HCl-Mg 反应监测流出液，反应呈明显阳性时，停止上样，记录上样量，计算总黄酮吸附量。树脂柱用蒸馏水清洗除杂，50% 乙醇洗脱至无色。收集50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，称重。分别测定洗脱物中总黄酮含量，并计算吸附-解析率。结果见表2。

表2 吸附浓度对瓜馥木总黄酮吸附-解析率和含量的影响Table 2 Effect of adsorption concentration on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

由上表可知，上样液浓度为1.0 g 生药材/mL时，总黄酮吸附-解析率和含量优于其他浓度，故最终选择上样液的浓度为1.0 g 生药材/mL。

3.2.1.2 吸附流速考察

将浓度为1.0 g 生药材/mL 的样品液通过AB-8型树脂柱，分别以1.0、2.0、3.0 mL/min 的流速进行动态吸附。用HCl-Mg 反应监测流出液，待反应呈明显阳性时，停止上样，记录上样量，计算总黄酮比吸附量。树脂柱用蒸馏水水清洗除杂，50%乙醇洗脱至无色。收集50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，称重。取50%乙醇洗脱物适量，分别测定洗脱物中总黄酮含量，计算吸附-解析率。结果见表3。

表3 吸附流速对瓜馥木总黄酮吸附-解析率和含量的影响Table 3 Effect of adsorption velocity on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

由表3 可知，流速为1.0 mL/min 时，总黄酮吸附-解析率和含量优于其他浓度，故最终选择上样液的浓度为1.0 mL/min。

3.2.1.3 树脂床径高比考察

选择相同直径(2.0 cm)色谱柱3 根，填装AB-8型树脂使树脂床径高比分别为1∶5、1∶7、1∶9。取浓度为1.0 g 生药材/mL 的样品液通过树脂柱，进行动态吸附。用HCl-Mg 反应监测流出液，待反应呈明显阳性时，停止上样，记录上样量，计算总黄酮比吸附量。树脂柱用蒸馏水水清洗除杂，50%乙醇洗脱至无色。收集50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，称重。取50%乙醇洗脱物适量，分别测定洗脱物中总黄酮含量，计算吸附-解析率。结果见表4。

表4 树脂床径高比对瓜馥木总黄酮吸附-解析率和含量的影响Table 4 Effect of diameter height ratio of resin bed on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

由上表可知，树脂床径高比为1∶5 和1∶7 时的含量和吸附-解析率明显优于1∶9 的含量和吸附解析率，1∶7 的含量和吸附-解析率比1∶5 较好，最终确定径高比为1∶7。

3.2.1.4 泄漏曲线考察

按上述所确定的吸附条件，取样品液通过AB-8型树脂床(径高比为1∶7)，吸附流速为1.0 mL/min，进行动态吸附，流出液每10 mL 收集一份，共收集20 份，每份流出液取一定体积，HCl-Mg 比色法测定总黄酮量并计算泄漏量。以每份总黄酮泄漏率为纵坐标，累计上样体积(mL)为横坐标绘制泄漏曲线。

图1 AB-8 大孔树脂纯化瓜馥木总黄酮泄漏曲线Fig.1 Leak curve of total flavonoids from F.oldhamii with AB-8 resins

由泄漏曲线(图1)可知，在上述吸附条件下，上样体积为550 mL 时，总黄酮开始泄漏明显。

3.2.2 除杂条件优化

3.2.2.1 除杂溶剂考察

取浓度为1.0 g 生药材/mL 的上样液550 mL，按已确定的最佳吸附条件进行动态吸附，待吸附完成后，树脂柱先分别用蒸馏水、5%乙醇和10%乙醇洗脱，再用50%乙醇洗脱至无色。收集50%乙醇洗脱液，蒸干，称重，测定总黄酮含量，计算吸附-解吸率。结果见表5。

由表5 可知，用5%乙醇溶剂除杂时，洗脱物总黄酮含量和吸附-解析率最高，因此确定除杂溶剂为5%乙醇。

3.2.2.2 除杂体积确定

取浓度为1.0 g 生药材/mL 的上样液550 mL，按已确定的最佳吸附条件进行动态吸附，待吸附完成后，树脂柱先分别用5%乙醇5 倍、7 倍、9 倍体积洗脱，再用50%乙醇洗脱至无色。收集50%乙醇洗脱液，蒸干，称重，测定总黄酮含量，计算吸附-解吸率。结果见表6。

表5 不同除杂溶剂对瓜馥木总黄酮吸附-解析率和含量的影响Table 5 Effect of different mixed solvent on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

表6 除杂体积对瓜馥木总黄酮吸附-解析率和含量的影响Table 6 Effect of mixed solvent multiple on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

由表6 可知，用7 倍5%乙醇除杂时，洗脱物总黄酮含量和吸附-解析率最高，因此确定除杂溶剂用量为7 倍。

3.2.3 洗脱条件优化

3.2.3.1 洗脱剂考察

取浓度为1.0 g 生药材/mL 的上样液550 mL，按已确定的最佳吸附条件进行动态吸附，待吸附完成后，树脂柱用5%乙醇7 BV 进行除杂，再分别用50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇洗脱至无色，洗脱流速为1.0 mL/min。分别收集洗脱液，回收溶剂，减压干燥，测定总黄酮含量，计算吸附-解析率。结果见表7。

表7 洗脱剂对瓜馥木总黄酮吸附-解析率和含量的影响Table 7 Effect of eluent on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

从表7 数据可知，用50%乙醇洗脱时，洗脱物总黄酮含量和吸附-解析率最高，故确定洗脱溶剂为50%乙醇。

3.2.3.2 洗脱流速考察

取浓度为1.0 g 生药材/mL 的上样液550 mL，分别通过3 根AB-8 型树脂床，按已确定的吸附及除杂条件操作，然后用50%乙醇洗脱至无色，洗脱流速分别为1.0、2.0、3.0 mL/min。收集50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，称重，测定总黄酮含量，计算吸附-解析率。结果见表8。

表8 洗脱流速对瓜馥木总黄酮吸附-解析率和含量的影响Table 8 Effect of elution velocity on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

从表8 数据可知，洗脱流速1.0 mL/min 时，洗脱物总黄酮含量最高，总黄酮吸附-解析率较高。从总黄酮含量考虑，故确定洗脱流速为1.0 mL/min。

3.2.3.3 洗脱曲线考察

取浓度为1.0 g 生药材/mL 的样品液通过AB-8 型树脂柱，按已确定的吸附、除杂和洗脱条件操作，等体积收集洗脱液(每20 mL 收集一份)，共收集10 份。洗脱液完全转移至蒸发皿中，蒸干溶剂并减压干燥，测定总黄酮量，计算洗脱量。以洗脱量为纵坐标，洗脱液体积为横坐标绘制洗脱曲线，见图2。

图2 AB-8 大孔树脂纯化瓜馥木总黄酮的洗脱曲Fig.2 Elution curve of total flavonoids from F.oldhamii with AB-8 resin

由洗脱曲线可知，当用50%乙醇洗脱120 mL时，总黄酮基本洗脱完全，因此确定洗脱体积为120 mL。

3.3 工艺验证试验

瓜馥木总黄酮最佳纯化工艺为:提取物上样液浓度为1.0 g 生药材/mL，吸附流速为1.0 mL/min，树脂床径高比为1∶7，最大上样量为550 mL，除杂溶剂为5%乙醇，除杂溶剂用量为140 mL(7 BV)，洗脱溶剂为50%乙醇，洗脱流速为1.0 mL/min，洗脱体积为160 mL(8 BV)，收集50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，得瓜馥木总黄酮。按上述工艺条件制备3 批样品，结果见表9。

表9 3 批样品瓜馥木总黄酮含量测定结果Table 9 Results of total flavonoids content in three batches samples(%;n=3)

3.4 瓜馥木总黄酮抗抑郁活性研究

3.4.1 对小鼠强迫游泳行为的影响

由表10 结果可见，阳性药盐酸氟西汀胶囊、瓜馥木总黄酮50 mg/kg 剂量给药组能明显缩短小鼠强迫游泳累积不动时间。

表10 瓜馥木总黄酮对小鼠强迫游泳行为的影响(±S)Table 10 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on the duration of immobility in the forced swimming test(±S)

表10 瓜馥木总黄酮对小鼠强迫游泳行为的影响(±S)Table 10 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on the duration of immobility in the forced swimming test(±S)

注:与对照组比较，* P＜0.05，＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，* P＜0.05，＊＊P＜0.01.

3.4.2 瓜馥木总黄酮对小鼠悬尾行为的影响

由表11 结果可见，阳性药盐酸氟西汀、瓜馥木总黄酮50、100 mg/kg 2 个剂量给药组均能明显缩短悬尾小鼠累计不动时间。

表11 瓜馥木总黄酮对小鼠悬尾行为的影响(±S)Table 11 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on the duration of immobility in tail suspension test(±S)

表11 瓜馥木总黄酮对小鼠悬尾行为的影响(±S)Table 11 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on the duration of immobility in tail suspension test(±S)

注:与对照组比较，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compare with control，* P＜0.05，＊＊P＜0.01.

3.4.3 瓜馥木总黄酮对小鼠自主运动行为的影响

由表12 结果可见，各给药组小鼠的自主运动情况与阳性对照和空白之间没有显著差异，提示抗抑郁剂量范围内的瓜馥木总黄酮没有明显的中枢兴奋或抑制作用。

表12 瓜馥木总黄酮对小鼠自主运动行为的影响(±S)Table 12 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on movement distance of mice in the open-field test(±S)

表12 瓜馥木总黄酮对小鼠自主运动行为的影响(±S)Table 12 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on movement distance of mice in the open-field test(±S)

4 讨论与结论

本实验在瓜馥木总黄酮部位纯化工艺用树脂的选择上，对5 种大孔树脂进行了对比选择，其中以AB-8 型树脂纯化效果最为理想。瓜馥木总黄酮的最佳纯化工艺为:药材90%乙醇提取液，减压回收溶剂至无醇味，残留物加药材10 倍量水超声分散，离心，得浓度1.0 g 生药材/mL 的上样液，加至已处理好的AB-8 型大孔吸附树脂床(径高比1∶7)，吸附流速1.0 mL/min，待树脂达到饱和吸附后，树脂床用7 BV 5%乙醇除杂，再用8 BV 50%乙醇洗脱，洗脱流速1.0 mL/min，收集50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，得瓜馥木总黄酮。经纯化后，产品中总黄酮的纯度提高到57.3%。由此可见，AB-8 大孔吸附树脂是瓜馥木总黄酮良好的纯化剂，对瓜馥木总黄酮有较高的吸附和解吸性能，适用于总黄酮的纯化研究。实验方法操作简单，所需成本低，能有效纯化瓜馥木总黄酮，回收率高，为瓜馥木的开发利用提供科学依据。

本研究采用经典抑郁动物模型小鼠悬尾、小鼠强迫游泳实验评价瓜馥木总黄酮的抗抑郁活性。结果表明，阳性药盐酸氟西汀胶囊、瓜馥木总黄酮50 mg/kg 剂量给药组均能明显缩短小鼠强迫游泳和悬尾的不动时间，且各给药组小鼠的自主运动情况与阳性对照和空白之间没有显著差异，提示瓜馥木总黄酮具有明确的抗抑郁作用。本实验中瓜馥木中、高剂量组(100、150 mg/kg)抗抑郁药效不明显，可能是随着给药剂量增加，药物作用靶点已经达到饱和。目前有关瓜馥木总黄酮抗抑郁活性的机制研究还未见报道，本研究结果也为进一步研究黄酮类化合物的抗抑郁机制、以及发展新结构及新作用的高效低毒抗抑郁剂提供了新的思路。

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