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Folin-Ciocalteu 比色法测定铜藻中褐藻多酚含量的研究

2015-01-11段海霞林云霞张金荣严小军骆其君

天然产物研究与开发 2015年8期
关键词:褐藻比色法工作液

段海霞,林云霞,张金荣,严小军,骆其君

宁波大学海洋学院 教育部应用海洋生物技术重点实验室,宁波 315211

铜藻(Sargassum horneri),又名丁香屋,隶属圆子纲(Cyclospreae)、墨角藻目(Fucales)、马尾藻科(Sargassaceae)、马尾藻属(Sargassum),为北太平洋西部特有的暖温带性海藻。铜藻在我国沿海分布广泛,是暖温带海域营造海洋牧场,进行生物修复海洋生态的首选品种[1]。铜藻作为海藻工业的优质原料,已广泛用于食品、饲料工业,具有较高的商业价值[2,3]。近年来,随着我国海藻资源开发利用研究的快速发展,铜藻因富含多糖、褐藻多酚、岩藻黄素等多种生物活性物质而引起了人们的广泛关注,但对其中褐藻多酚的研究不多[4]。褐藻多酚(phlorotannins)是海洋褐藻中重要的次级代谢产物,化学结构上是一类以间苯三酚为基础骨架的独特的多酚类化合物,其聚合度可以几个至几百个,并具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗心血管疾病、抗糖尿病综合症、保肝等多种生物活性[5-7]。严小军等以Folin-Denis法测定了中国常见海藻的褐藻多酚含量,并研究了褐藻多酚含量随海藻生长及季节的变化规律[8]。

目前,植物多酚含量测定的最常见方法——Folin-Ciocalteu 比色法[9-11]。鉴于褐藻多酚的化学结构类型为多酚类化合物,故本研究选择Folin-Ciocalteu 比色法进行铜藻中褐藻多酚的含量测定。以没食子酸为标准品,分别考察检测波长、显色温度、显色时间、Folin-Ciocalteu 试剂和碱液用量等测定条件对Folin-Ciocalteu 比色法的影响,确定Folin-Ciocalteu 比色法测定铜藻中褐藻多酚含量的最优条件,为铜藻中褐藻多酚提取工艺的研究提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

新鲜铜藻于2013 年5 月采自浙江温州南麂岛,样品由宁波大学骆其君教授鉴定,编号为NJD20130501,保存于宁波大学海洋学院。

1.2 仪器

752N 紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);HH-4 数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司);SB4200D 超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);BSA124S-CW 电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);超纯水仪(Pall 公司);RXZ-380B 型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂);移液器(德国Eppendorf 公司);1 cm 石英比色皿(上海尤尼柯仪器有限公司)。

1.3 试剂

Folin-Ciocalteu 试 剂(Sigma 公 司,批 号BCBL4436V);没食子酸标准品(Sigma 公司,批号AGM01-HOSS);其余试剂均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 没食子酸标准溶液的配制

精密称取没食子酸对照品0.100 g,用重蒸馏水完全溶解并定容至100 mL,配成质量浓度1000 μg/mL 没食子酸储备溶液(现配)。

2.2 没食子酸工作液的配制

用移液管分别移取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL 的没食子酸标准储备液于100 mL容量瓶中,分别加水定容至刻度,摇匀,配置质量浓度分别为15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL 的没食子酸工作液,待用。

2.3 供试品溶液的制备

称取新鲜铜藻1.000 g 于锥形瓶中,加入50 mL 60%(V/V)乙醇溶液,40 ℃超声提取30 min,过滤至50 mL 容量瓶,加60%乙醇定容至50 mL,待用。

2.4 Folin-Ciocalteu 法测定褐藻多酚的比色条件优化

2.4.1 检测波长的选取

精密量取没食子酸工作液(50 μg/mL)、供试品溶液1.0 mL 于10 mL 容量瓶中,分别加水稀释,加1.25 mL Folin-Ciocalteu 试剂,混匀,3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液,加水定容至10 mL,混匀,30 ℃避光反应60 min,以试剂空白为对照,在400~800 nm 范围内扫描确定最大吸收波长。

2.4.2 显色温度的考察

精密量取没食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL,加水稀释,加入Folin-Ciocalteu 试剂1.25 mL,混匀,3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液,加水定容至10 mL,混匀,分别于15、20、25、30、35、40 ℃条件下避光反应60 min,以试剂空白为对照,在760 nm 处测定溶液吸光值,以考察反应温度对比色效果的影响。

2.4.3 显色时间的影响

取没食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL,加水稀释,加入Folin-Ciocalteu 试剂1.25 mL,混匀,3 min后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液,加水定容至10 mL,混匀,30 ℃分别避光反应30、60、90、120、150、180 min,以试剂空白为对照,在760 nm 处测定溶液吸光度,以确定显色完全的最佳时间。

2.4.4 Folin-Ciocalteu 试剂的加入量

取没食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL,加水稀释,分别加入0.75、1.0、1.25、1.5、1.75 mL Folin-Ciocalteu 试剂,混匀,3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液,加水定容至10 mL,混匀,30 ℃避光反应60 min,以试剂空白为对照,在760 nm 处测定溶液吸光度,以考察Folin-Ciocalteu 试剂用量对显色效果的影响。

2.4.5 Na2CO3溶液用量的确定

取没食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL,加水稀释,加Folin-Ciocalteu 试剂1.25 mL,混匀,3 min,分别加入3.2、4.0、4.8、5.6、6.4 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液,加水定容至10 mL,混匀,30 ℃避光反应60 min,以试剂空白为对照,在760 nm 处测定溶液吸光度,考察Na2CO3溶液用量对吸光度的影响。

2.5 标准曲线的绘制

精密量取不同浓度的没食子酸工作液各1.0 mL 于10 mL 的容量瓶中,加水稀释,分别加入1.25 mL Folin-Ciocalteu 试剂,混匀,3 min 后加入0.1 g/mL Na2CO3溶液4.0 mL,加水定容至10 mL,混匀,30 ℃避光反应60 min,以试剂空白为对照,在760 nm 处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,没食子酸溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线,褐藻多酚含量以没食子酸标准品计。

2.6 Folin-Ciocalteu 法测定铜藻中褐藻多酚的方法学评价

2.6.1 稳定性实验

精密量取同一铜藻供试品溶液按2.4 的测定条件,分别在样品液与显色剂反应完全(60 min)后的0、30、60、90、120 min 测定吸光度,以评价该方法在一段时间内的稳定性。

2.6.2 重现性实验

分别取同一铜藻样品5 份,依2.3 的方法制备供试品溶液,分别测定其多酚含量,计算结果的相对标准偏差(RSD),以评价该方法的重现性。

2.6.3 精密度实验

采用优化的Folin-Ciocalteu 比色法对同一铜藻供试液测定5 次,并计算结果的相对标准偏差(RSD),以评价该方法的精密度。

2.6.4 加标回收实验

精密量取已知含量的铜藻供试品溶液0.5 mL,6 份,分别加入1000 μg/mL 没食子酸工作液0.14、0.14、0.17、0.17、0.20、0.20 mL,加水稀释,混匀,加入Folin-Ciocalteu 试剂1.25 mL,混匀,3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液,加水定容至10 mL,混匀,30 ℃避光反应60 min,分别测定混合样品中褐藻多酚含量,并计算其回收率和相对标准偏差,以评价该分析方法的准确性和可靠性。

2.7 含量测定

精确量取2.3 中的铜藻供试液1.0 mL,5 份,加水稀释,混匀,加入Folin-Ciocalteu 试剂1.25 mL,混匀,3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液,加水定容至10 mL,混匀,30 ℃避光反应60 min。反应完全后,利用紫外-可见分光光度计,于760 nm 下测定体系吸光值,根据没食子酸标准品所得标准曲线,计算铜藻供试液中褐藻多酚的含量,公式如下:

褐藻多酚含量(mg/g)=C×V/m

式中,C:铜藻供试液中多酚浓度(mg/mL);V:铜藻供试液总体积(mL);m:铜藻质量(g)。

3 结果与分析

3.1 检测波长的确定

多酚类物质与Folin-Ciocalteu 试剂反应显色是基于Folin-Ciocalteu 试剂中的钨钼酸能将多酚化合物定量氧化,自身被还原,生成蓝色物质,在680~780 nm 有较大吸收,测定显色反应后溶液的紫外-可见吸收光谱,选择最大吸收波长作为比色法的测定波长。图1 为没食子酸工作液(50 μg/mL)和供试品溶液分别与Folin-Ciocalteu 试剂显色后的全波长扫描图,由图1 可知,两者均在760 nm 处有最大吸收,故选择760 nm 为检测波长。

图1 没食子酸(a)、供试品(b)和试剂空白(c)分别与Folin-Ciocalteu 试剂显色后的全波长扫描Fig.1 Scanning spectra of gallic acid(a),testing solutions(b)and sample blank(c)reacted with Folin-Ciocalteu reagent

3.2 显色温度和时间的确定

图2 吸光度随反应温度的变化Fig.2 The absorbance at different reaction temperatures

酚类化合物与Folin-Ciocalteu 试剂反应需要一定显色温度和时间才能显色完全。由图2 可知,没食子酸标准溶液在不同温度条件下显色,显色温度对比色效果影响较大,反应温度过低、过高均不利于多酚显色。当温度低于30 ℃时,吸光度较小。30℃显色,反应60 min 时,吸光度达到最大,吸光值为0.705。35~40 ℃,显色60 min 时,吸光度逐渐减小。说明温度高能加快显色进程,但是温度过高,反应体系的稳定性较差。综合考虑显色的完全程度和反应体系的稳定性,确定显色温度为30 ℃。

图3 吸光度随反应时间的变化Fig.3 The absorbance at different reaction times

没食子酸标准溶液在不同温度条件下显色,达到最大吸光度的时间有差异。由图3 可知,没食子酸标准溶液与Folin-Ciocalteu 试剂在30 ℃条件下,避光反应,显色时间60 min 内,随着时间的延长,吸光度增大。当显色60 min 时体系吸光度达到最大。显色60 min 后,体系吸光度变化很小,表明显色反应基本完全,显色体系稳定性很好。因此,确定Folin-Ciocalteu 比色法的反应时间为60 min。

综上所述,确定Folin-Ciocalteu 比色法测定褐藻多酚含量的显色温度为30 ℃,显色时间为60 min。

图4 吸光度随Folin-Ciocalteu 试剂用量的变化Fig.4 The absorbance at different addition amounts of Folin-Ciocalteu reagent

3.3 Folin-Ciocalteu 显色剂和Na2CO3加入量的确定

Folin-Ciocalteu 显色剂的用量对显色效果具有较大影响,由图4 可知,Folin-Ciocalteu 试剂用量在0.75~1.75 mL 内,随着显色剂用量的增加,测得的吸光度增加;当Folin-Ciocalteu 试剂加入量为1.25 mL,吸光度达到最大,吸光值为0.707。当显色剂用量超过1.25 mL 后,吸光度略有下降。因此,确定Folin-Ciocalteu 试剂的加入量为1.25 mL。

图5 吸光度随10% Na2CO3溶液加入量的变化Fig.5 The absorbance at different addition amount of 10%Na2CO3solution

酚类化合物与Folin-Ciocalteu 试剂反应必须在碱性条件才可以显色,反应体系中Na2CO3溶液是显色的支持介质。由图5 可知:随着Na2CO3用量的增加,体系吸光度逐渐升高,当Na2CO3用量为4.0 mL 时,吸光度达到最大。但进一步增加Na2CO3溶液吸光度变化幅度不大,因此确定0.1 g/mL Na2CO3溶液的加入量为4.0 mL。

3.4 标准曲线的绘制

精密量取不同浓度的没食子酸工作液各1.0 mL,按照2.4 确定的最优比色条件绘制标准曲线,得线性回归方程为Y=0.0138X+0.0267,相关系数R2=0.9993。表明没食子酸质量浓度在15~50 μg/mL 范围内,与其吸光值呈良好的线性关系,符合朗伯-比尔定律,可用于铜藻中褐藻多酚的含量测定。

3.5 Folin-Ciocalteu 法测定褐藻中褐藻多酚的方法学评价

稳定性实验:对Folin-Ciocalteu 比色法测定的铜藻中的褐藻多酚进行稳定性实验,反应完全后在30℃下避光放置0、30、60、90、120 min 后测定吸光值,其吸光值分别为0.508、0.501、0.499、0.512、0.499,结果表明随着时间的延长,吸光度值略有下降,但幅度不大,相对标准偏差(RSD)为1.169%,表明120 min 内溶液稳定性良好。

精密度实验:对Folin-Ciocalteu 比色法测定的铜藻中的褐藻多酚进行精密度实验,同一样液测定5次,吸光值分别为0.487、0.491、0.510、0.497、0.497,其相对标准偏差(RSD)为1.754%,表明该方法具有较高的精密度,能够满足样液分析的要求。

重现性实验:对Folin-Ciocalteu 比色法测定的铜藻中的褐藻多酚进行重现性实验,取同一批铜藻样品5 份,各1.0 g,精密称定,按2.3 的方法,分别测定吸光度,吸光值分别为0.488、0.492、0.498、0.499、0.502,其相对标准偏差(RSD)1.145%,表明该方法具有良好的重现性。

加标回收率试验:按照2.6 的方法进行加标回收试验,由表1 可以看出采用Folin-Ciocalteu 比色法测定铜藻中褐藻多酚的加标试验中,回收率最高的为99.36%,最低为92.50%,平均回收率96.18%,其RSD 为2.44%。结果表明,该方法具有较高的准确性和可靠性,可以用于铜藻中褐藻多酚含量的测定。

3.6 铜藻中褐藻多酚的含量

按照2.7 中的方法测定铜藻中褐藻多酚的含量分别为17.44、17.58、17.08、17.18、17.51 mg/g,其平均含量为17.36 mg/g(RSD=1.25%)。

表1 加标回收率试验结果Table 1 Results of recovery experiment

4 结果与讨论

综上所述,考虑影响多酚含量测定的主要因素:检测波长、显色温度、显色时间、Folin-Ciocalteu 试剂和碱液用量,确定Folin-Ciocalteu 比色法测定铜藻中褐藻多酚含量的测定条件为:精密量取铜藻供品溶液1.0 mL,加水稀释,加1.25 mL Folin-Ciocalteu 试剂,混匀,3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液,加水定容至10 mL,混匀,30 ℃避光反应60 min,以试剂空白为对照,在760 nm 波长处测定吸光度。方法学实验证明该方法具有操作简单、精密度高、稳定性好、准确可靠等优点,可用于铜藻中褐藻多酚含量的测定。

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