李 健，刘 飞，刘大飞，罗其勇，李一经，刘春国4,⋆

1.重庆自然博物馆，重庆 400700；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.广西科技大学，广西 柳州 545006；4.东北农业大学动物医学院，黑龙江 哈尔滨 150030; 5.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150001）

H 3N2亚型禽流感病毒分离鉴定及HA和NA基因序列分析

李 健1，刘 飞2，刘大飞5，罗其勇3，李一经4⋆，刘春国4,5⋆

1.重庆自然博物馆，重庆 400700；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.广西科技大学，广西 柳州 545006；4.东北农业大学动物医学院，黑龙江 哈尔滨 150030; 5.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150001）

为了研究野生禽类H 3N 2亚型低致病性禽流感病毒的分子特征，本研究从野鸭粪便样本中分离到一株禽流感病毒，通过血凝抑制试验证实分离株为H 3亚型流感病毒，命名为A/Mallard/Q iqihaer/0726/2013(H 3N 2)。对其血凝素和神经氨酸酶基因进行了克隆和序列分析，核苷酸序列比对结果表明分离株HA基因与H 3N 8亚型A/M al⁃lard/SanJiang/90/2006(H 3N 8)的同源性最高，达到99.5%，NA基因与H 5N 2亚型A/northern pintail/Akita/714/2006 (H 5N 2)的同源性最高，达到99.4%。系统发育树分析进一步证实分离株的HA和NA基因可能分别来自于H 3N 8亚型和H 5N 2亚型禽流感病毒，是一株重排病毒。本研究为H 3N 2亚型禽流感病毒的遗传进化机制提供了理论数据。

野鸭；流感病毒；H3N 2亚型；HA基因；NA基因；重排

禽流感病毒（Avian inf luenza virus,AIV）属于正黏病毒科A型流感病毒属，水禽是其自然储存宿主，尤其是野生水禽，其在流感病毒的进化中发挥着重要作用。目前已证明AIV有17个血凝素（Hemagglutinin,HA）亚型和10个神经酸酶亚型[1-2]。在这些亚型中除了大部分H5和H7亚型为高致病性AIV外，其他的均为低致病性AIV。而在低致病性AIV中，H3亚型AIV是最常见的，占有主要优势。H3亚型流感病毒能够感染猪、人、禽、犬、猫、马和海豹等多种宿主[3-7]。重排在流感病毒进化过程中发挥重要作用[2,8-9]。研究表明H3亚型AIV通过重排能够直接感染人[10]。1968年香港H3N2亚型流感大流行毒株就是由重排而来[11]。因此，对H3亚型流感病毒进行监测对了解流感病毒的遗传进化机制和发现具有潜在威胁的遗传重排毒株的出现具有重要的公共卫生学意义。本研究对齐齐哈尔扎龙自然保护区的野鸟粪便样本进行禽流感病原流行病学调查时分离到一株H3N2亚型AIV，并对其HA和NA基因序列进行了分子和遗传分析。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和拭子 M-MLV反转录酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、RNA酶抑制剂、pMD-18T载体等购自大连宝生物工程公司；AxyPrep体液病毒RNA小量制备试剂盒、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自康宁生命科学（吴江）有限公司；H3N2亚型禽流感标准阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司；野鸭粪便采自齐齐哈尔扎龙自然保护区。

1.2 引物设计 根据GenBank中H3N2亚型AIV HA基因的核苷酸序列，应用primer premier 6.0软件设计引物，由吉林省库美生物科技有限公司合成。反转录引物序列uni-12：5’-AGCAAAAGCAGG-3’。HA基因引物序列：HA-up：5’-AGCAAAAGCAGGGGATACCTGC-3’，HA-low：5’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTGTAATTATC-3’。NA基因引物序列：NA-up：5’-TTGCTTGGTCGGCAAGTGC-3’，NA-low：5’-CCAGTCCACCCATTTGGATCC-3’。

1.3 病毒分离及HA亚型鉴定 野鸭粪便用PBS按1∶5稀释后，离心，上清用0.22μm的滤膜进行过滤，滤液按常规方法接种11日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.2 mL，37℃孵育，每天观察，72 h后，收集鸡胚尿囊液，测定血凝效价。将具有血凝价的鸡胚尿囊液与H3N2亚型AI标准阳性血清进行HI试验，将反应阳性的尿囊液分装，-70℃保存备用。

1.4 病毒核酸提取及cDNA的制备 参考AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒说明书提取病毒RNA。然后参考M-MLV反转录酶说明书，用uni-12反转录引物进行反转录，合成cDNA[8]。

1.5 HA和NA基因的扩增及测序 以cDNA为模板，用HA和NA基因特异性引物HA-up/HA-low和NA-up/ NA-low进行PCR扩增。反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸2 min；共进行30个循环，最后72℃延伸10 min，随后用1%琼脂糖凝胶进行电泳。切取HA和NA基因特异性条带，用胶回收试剂盒进行纯化，然后连接pMD-18T载体，转化TOP10感受态细胞，挑选经菌落PCR鉴定阳性的菌液送往吉林省库美生物科技有限公司进行测序。

1.6 HA和NA基因的分子及遗传特征分析 将测序结果用Lasergene软件中的SeqMan程序进行序列拼接，然后进行Blast比对。从流感数据库中下载H3N2亚型AIV参考毒株的HA和NA基因序列，用Lasergene软件中的MegAl ign程序对HA和NA基因基因核苷酸和氨基酸序列进行同源性比对。用MEGA5.0软件中的邻接法构建HA和NA基因的系统发育树。

2 结果和分析

2.1 病毒的分离鉴定 野鸭粪便样本接种鸡胚后收集的尿囊液能够凝集鸡红细胞，HA效价能够达到1∶256。H3N2亚型AI标准阳性血清能够抑制病毒的凝集效应，HAI效价达到1∶512，证明尿囊液中含有H3亚型AIV。2.2 HA和NA基因的PCR鉴定 用H3N2亚型AIV HA和NA基因特异性引物对制备的cDNA进行PCR扩增，产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，可见在1 700 bp和1 400 bp处出现特异性条带，与预期结果相符（见图1）。

图1 HA和NA基因的PCR扩增产物Fig.1 PCR p roduct of HA and NA gene

2.3 HA和NA序列分析 测序结果分析显示，HA基因全长1 765 nt，编码区位于30～1 730 nt之间，长1 701 nt，共编码566个氨基酸。NA基因全长1 413 nt，编码区长1 410 nt，位于20-1 429 nt之间，共编码469个氨基酸。对HA基因核酸序列分析表明，分离株A/Mal lard/Qiqihaer/0726/2013（H3N2）与参考株A/Mal lard/SanJiang/90/2006（H3N8）的同源性最高，为99.5%，而氨基酸序列同源性最高的毒株为A/duck/Mongol ia/OIE-7799/2011（H3N2），达到98.9%。对NA基因核酸序列分析表明，分离株A/Mal lard/Qiqihaer/0726/2013（H3N2）与参考株A/ nor thern pintai l/Akita/714/2006（H5N2）的同源性最高，达到99.4%，而氨基酸序列同源性最高的毒株为A/duck/Shimane/19/2006（H5N2），达到99.6%（表1）。氨基酸序列进一步分析表明HA蛋白共有6个潜在的N糖基化位点，分别为第8位NST、22位NGT、38位NAT、165位NVT、285位NGS和483位NGT，与A/Duck/Hei longj iang/1/2014（H3N2）的基本相同[12]，而与A/Duck/Ukraine/1/63（H3N8）比较，在81位缺少一个糖基化位点。NA蛋白共有5个潜在的N糖基化位点，分别为61位NIT、69位NNT、70位NTT、146

位NGT和234位NGT。NA蛋白推衍的氨基酸序列分析发现除了参考株A/chicken/Nanchang/3-120/2001（H3N2）和A/duck/Zhej iang/D13/2013（H3N2）的63ITEI65位氨基酸发生缺失外，包括本研究中的分离株在内的其余所有毒株均为发生缺失。抗原位点分析发现，分离株与A/swine/Inner_Mongol ia/547/2001（H3N2）的完全相同，而与A/Duck/Ukraine/1963（H3N8）相比，分离株的抗原决定簇A和B区的氨基酸位点均发生一定程度的改变。A区S137N，B区N145S；受体结合位点226及228位均为Q和G[12]。HA裂解位点均为PEKQTRGLF[13]。

2.4 HA和NA基因系统发育树构建 根据分离株A/ Mal lard/Qiqihaer/0726/2013（H3N2）的HA和NA基因核酸序列构建系统发育树。结果表明分离株HA基因与A/Mal lard/SanJiang/90/2006（H3N8）的亲缘关系最近（图2），NA基因与A/garganey/SanJiang/160/ 2006（H5N2）的亲缘关系最近（图3）。HA和NA基因均与亚洲国家分离株的对应基因共处于同一进化分支内，而与美洲H3N2亚型AIV的相应基因处于不同的进化分支。

3 讨论

表1 分离株HA和NA基因同源性序列比较Table1 Sequence com parisons o f HA and NA genes of the isolate w ith its closest genetic re latives

图2 HA基因的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree o f HA gene

野鸟是流感病毒的自然储存宿主，多种亚型AIV在野鸟不断分离到，并为流感病毒的重排提供基因片段，导致可能具有高致病性新毒株的出现，造成重大公共卫生事件[14]，因此，野鸟在AI的流行中扮演重要角色。H3N2亚型AIV属于低致病性流感亚型，在野鸟以及家养水禽中普遍存在。近年来具有重排特征的H3N2亚型AIV不断被发现，这增加了重排毒株流行的潜在风险，因此，开展H3N2亚型低致病性AI的分子流行病学调查具有重要的理论和实践意义。

本研究从野鸭粪便样本中分离到一株H3N2亚型AIV，分子分析发现HA蛋白裂解位点为PEKQTRGLF，具有低致病性AIV的分子特征。抗原位点分析发现该毒株与A/swine/Inner_Mongol ia/ 547/2001（H3N2）的完全相同，而与A/Duck/Ukraine/ 1963（H3N8）相比，分离株的抗原决定簇A和B区的氨基酸位点均发生一定程度的改变。同源性和系统发育树分析表明该毒株是一株重排的病毒。其HA基因来源于亚洲H3N8亚型AIV，NA基因来源于亚洲H5N2亚型AIV。这些变异表明，随着时间迁移，病毒在环境、宿主以及自身的选择压力下也在发生着适应性进化。

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Isolation，identification and sequence analysis ofa H3N2 subtype influenza virus originated from w ild duck

Li Jian1,Liu Fei2,Liu Dafei5,Luo Qiyong3,Li Yi j ing4*,Liu Chunguo4,5*
(1.Chongqing natural history museum,Chongqing 400700; 2.Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS,Shanghai 200241; 3.Guangxi University of science and technology,Guangxi Liuzhou 545006; 4.Col lege of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Hei longj iang Harbin 150030; 5.Haerbin Veterinary Research Institute,CAAS,Hei longj iang Harbin 150001）

To investigate the genetic characteristics of H3N2 subtype avian inf luenza virus (AIV),the isolation of viruses f rom wi ld duck fecal samples was carried out.A H3N2 subtype AIV A/Mal lard/Qiqihaer/0726/2013(H3N2) was isolated and identi fied by hemagglutination inhibition tests and sequencing.The hemagglutinin(HA)and neuraminidase(NA)genes were cloned and analyzed.The resul ts showed that the HA gene of A/Mal lard/Qiqihaer/0726/2013(H3N2)was closely related with A/Mal lard/SanJiang/90/2006(H3N8)with the highest homology of 99.5%,and the NA gene was closely related with A/nor thern pintail/Akita/714/2006(H5N2)with the highest homology of 99.4%.Phylogenetic tree analysis further conf irmed that the HA and NA genes of A/Mal lard/Qiqi-haer/0726/2013(H3N2)derived f rom H3N8 and H5N2 subtype wild bird AIV,respectively.The present research has provided new theoretical data for the H3N2 subtype of AIV genetic evolution mechanism.

Wi ld duck;Inf luenza virus;H3N2 subtypes;HA gene;NA gene;Reassor tment

S855.3

1672-9692(2015)08-0001-06

2015-05-30

李健（1979-），男，博士生，馆员，主要从事野生动物生态学研究。

刘春国（1978-），男，博士，助理研究员，主要从事自然疫源性人兽共患病研究。

李一经（1960-），男，博士，教授，博士生导师，主要从事动物微生物与免疫学研究。

黑龙江省博士后资助经费项目(LBH-Z13043)，中国博士后科学基金资助项目（2014M561320）