李玉妹，刘春凤，李崎

1(江南大学教育部工业生物技术重点实验室，江苏无锡，214122)

2(江南大学酿酒科学与工程研究室，江苏无锡，214122)

原花青素(procyanidins，PC)是一种由黄烷-3-醇单体缩合而成的聚多酚类物质，因在酸性介质中加热可产生相应的花色素而得名。由于其聚合体还表现出单宁特性，因此也称为缩合单宁［1］，广泛存在于各种植物的核、皮或种籽等部位［2］，因其来源不同，其结构、组成及其生理活性也不同。目前，应用范围最广泛的为葡萄籽原花青素。作为多酚类物质原花青素具有极强的抗氧化和自由基清除能力，能有效地清除HO·、O2-·、DPPH·等自由基［3-4］。

原花青素为极性物质，萃取溶剂可选用甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯等极性溶剂，提取溶剂对原花青素的选择性及产物的组成有不同影响［5］。乙酸乙酯极性最小，对原花青素的提取不完全;甲醇和丙酮对原花青素均有较好的提取性能，但二者均有毒性，且研究表明，原花青素在甲醇中可能解聚［6］。乙醇是常用的提取溶剂，溶解性能好，穿透细胞能力强，能增强溶质的稳定性，价格低廉，且毒性小。原花青素在pH＞5的条件下不稳定，会发生解聚合，而低聚原花青素(如原花青素B2、B5)，在pH＜4的环境下也会自氧化解聚，所以提取溶剂的pH值需控制在4～5的弱酸性内［7］。

啤酒中原花青素主要来源于麦芽和酒花，其中70%来自麦芽，30%来自酒花［8］。一方面作为抗氧化物质，原花青素对抑制啤酒老化有积极影响，能延长啤酒保鲜期，增加啤酒风味稳定性［9］;另一方面，作为多酚类物质，原花青素易与蛋白结合沉淀，影响啤酒储存过程中的胶体稳定性［10］。本文通过对原料麦芽中原花青素提取条件的研究，建立了适宜提取条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用多酚酒花颗粒，札一香花和青岛大花为玉门拓璞酒花公司提供;进口澳麦及国产麦芽为市购;(+)-儿茶素标准品购自美国Sigma公司;AB-8大孔吸附树脂购自天津南开合成有限公司;甲醇、香草醛、无水乙醇、浓HCl等试剂为分析纯;实验用水均为去离子水，使用前经0.45 μm无机膜过滤。

1.2 主要仪器与设备

HB-10旋转蒸发仪，德国IKA公司;Laboport真空抽滤机，德国KNF公司;KQ3200DB型数控超声仪，昆山超声仪器公司;AL204电子天平，MettlerToledo公司;离心机，德国Eppendorf公司;玻璃层析柱(φ10 mm ×200 mm)，上海生工。

1.3 实验方法

1.3.1 原花青素质量浓度测定

标准曲线绘制:精确称取儿茶素标准品配制1.0 mg/mL的标准溶液，再分别取 0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL定容至10 mL。利用浓盐酸香草醛法［12］测定吸光值，绘制标准曲线。得到回归线性方程为y=603.38x+4.2152(其中y为儿茶素质量浓度μg/mL，x为吸光度值)，R2=0.999 1。

样品测定:取待测液1 mL，依次加入4 g/100 mL香草醛-甲醇溶液3 mL，浓HCl1.5 mL，混匀后于20℃水浴15 min，在500 nm处测吸光度，(以1 mL甲醇代替待测液作为空白对照)。操作过程避光进行。得到吸光值代入标准曲线线性方程，得到原花青素浓度。

1.3.2 麦芽原花青素有机溶剂提取

分别精确称取1 g进口澳麦麦芽，按浸提温度(℃)、浸提液乙醇体积分数(%)、料液比(g∶mL)、最佳浸提时间(h)优化提取条件，提取过程在弱酸性条件下进行(调节pH=4)。粗提液过滤后定容至25 mL，采用香草醛浓盐酸法测吸光度，以原花青素浓度为指标，考察不同提取条件下的提取效果。

1.3.3 AB-8大孔吸附树脂动态吸附条件选择

AB-8大孔吸附树脂经过预处理后装入φ10 mm×200 mm的玻璃层析柱中，装柱体积13 mL。将用最佳提取条件下萃取的麦芽原花青素粗提液(调节pH=4)通入树脂，控制流速，分部收集流出液(1 mL/管)，当流出液中原花青素浓度达到上样浓度1/10［13］时停止上样，计算动态吸附量。分别考察上样流速和上样液浓度对树脂吸附麦芽原花青素的影响，确定合适的上样吸附条件。

吸附通量=上样液浓度(mg/mL)×流出液体积(mL)

1.3.3 AB-8大孔吸附树脂动态解吸条件选择

将用最佳提取条件萃取的麦芽原花青素粗提液，按确定的最佳吸附条件进行吸附，用乙醇进行洗脱。分部收集流出液，测定其中原花青素质量浓度，计算解吸率。考察洗脱液乙醇体积分数、解吸速率及洗脱液乙醇体积对解吸效果的影响。

1.3.4 酒花中原花青素提取方法［11］

2 结果与讨论

2.1 麦芽中原花青素有机溶剂萃取条件的确定

2.1.1 温度对原花青素提取效果的影响

用体积分数60%乙醇作为提取溶剂，料液比1∶20，提取时间1.5 h，研究提取温度对原花青素提取效果的影响。结果如图1所示。在25～55℃内随着温度的升高，提取得率略有上升，但是，随着温度的继续上升，70℃时提取得率略有下降，这是因为在高温下多酚类物质不稳定，容易氧化，使得得率有所下降。但当温度处于萃取溶剂沸腾温度时，原花青素质量浓度明显增加，分析原因，可能是因为溶剂沸腾时，增加了料液接触面积，并且在沸腾时溶剂迅速脱氧，有效减少了原花青素的氧化损耗。选择85℃作为提取温度。

图1 提取温度对提取效果的影响Fig.1 Effect of temperature on the extraction

2.1.2 乙醇浓度对原花青素提取效果的影响

用乙醇作为提取溶剂，提取温度85℃，料液比1∶20(g∶mL)，提取时间 1.5 h，研究乙醇浓度对原花青素提取效果的影响，结果如图2所示。

图2 乙醇浓度对提取效果的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction

多酚类物质含有酚羟基，有一定的极性，提取溶剂乙醇的体积分数不同影响了提取溶剂的极性，进而影响对多酚类物质的溶解度及选择性，所以只有在合适的乙醇浓度下才会有较高的原花青素得率。在乙醇体积分数10% ～60%内，随着乙醇浓度的升高提取液原花青素的浓度逐渐升高，而且实验过程中发现，低浓度乙醇的提取液呈糊状比较难过滤，而且滤液较混浊。而高浓度乙醇对多酚类物质有较好提取效果的同时对蛋白和多糖有较强的沉淀能力，提取液也更容易过滤。60%和70%乙醇都有较好的提取效果，综合考虑后，选择60%乙醇作为提取溶剂浓度。

2.1.3 料液比对原花青素提取效果的影响

用60%乙醇作为提取溶剂，提取温度85℃，提取时间1.5 h，研究提取料液比对原花青素提取效果的影响，结果如图3所示。

图3 料液比对提取效果的影响Fig.3 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction

麦芽中原花青素的提取是溶质溶剂化的过程，在一定范围内，随着提取溶剂的增加，能被浸取出来的物质就越多。而随着提取溶剂用量的继续增加，扩散达到平衡，再增加溶剂量也不会使浸出物质有所增加。同时，提取溶剂用量的增大，对后面的过滤、浓缩会造成较大的负担。料液比1∶20(g∶mL)时，已经有较高的原花青素浓度，综合考虑选择1∶25(g∶mL)左右作为提取料液比。

2.1.4 提取时间对原花青素提取效果的影响

用60%乙醇作为提取溶剂，提取温度85℃，料液比1∶25(g∶mL)，研究提取时间对原花青素提取效果的影响，结果如图4所示。

图4 提取时间对提取效果的影响Fig.4 Effect of extraction tine on the extraction

结果表明，在0.5～1.5 h内，随着提取时间的延长，原花青素提取得率有所增加，浸提时间短，与蛋白质、纤维素结合的酚类物质来不及溶出，提取时间过长，由于多酚类物质稳定性不好，容易发生分解破坏，所以1.5 h后，随着时间延长，提取液原花青素浓度呈下降趋势。选择提取效果最好的1.5 h作为提取时间。

2.2 麦芽原花青素提取的正交优化实验

根据单因素实验结果，设计4因素3水平的正交实验(表1)，结果及分析见表2。

表1 原花青素提取的正交实验L9(34)因素水平Table 1 Factors and levels in the L9(34)orthogonal experiments array for extraction of procyanidins

表2 正交实验方案及结果分析Table 2 Arrangement and result analysis of orthogonal experiments

由表2正交实验结果及极差分析可以看出，各因素对原花青素提取效果的影响由大到小依次为乙醇浓度＞温度＞提取时间＞料液比，极差分析得到的最佳提取条件为温度85℃、乙醇浓度60%、料液比1∶30、时间1.5h。但是结合单因素实验，料液比1∶25(g∶mL)时，已经有较高的原花青素浓度，此时继续增加提取溶剂用量，原花青素浓度提高并不明显。同时，提取溶剂用量的增大，对后面的过滤、浓缩会造成较大的负担。所以选择1∶25(g∶mL)作为提取料液比。因此得出原花青素最佳提取条件为，温度85℃、乙醇浓度60%、料液比1∶25、提取时间1.5h。以此为条件进行3次平行验证实验，结果如表3所示。

表3 提取条件验证Table 3 Confirmation of extraction conditions

由表3可知，在已确定的提取条件下，麦芽原花青素的得率稳定，且与正交实验最大值相近，说明提取方法可行。

2.3 AB-8大孔吸附树脂动态吸附条件确定

有机溶剂萃取的麦芽原花青素提取液，杂质含量较高，需进一步上柱进行纯化分离，研究表明，AB-8树脂的性质不但对大麦多酚类极性物质的选择性较强，吸附量大，而且容易被解吸，回收率高［14］。经本实验室前期研究发现，原花青素在AB-8树脂上具有很好的吸附解吸效果［11］，所以选择AB-8树脂对麦芽粗提液进一步分离纯化。

2.3.1 上样流速对吸附量的影响

控制上样浓度0.57 mg/mL，比较不同上样流速下AB-8大孔树脂的吸附通量。由图5可知，AB-8大孔吸附树脂对麦芽原花青素的吸附通量，随上样流速的增加而减少，这是因为上样流速的变化影响了溶质向树脂内表面的扩散，进而影响吸附效果。随着上柱流速增大，样品溶液中的原花青素和树脂没有足够长的时间接触，溶质分子来不及扩散到树脂内表面，使树脂的吸附量下降。但是虽然较低的流速对吸附有利，但流速过低，操作时间长，造成过多的工作负担，所以选择上样流速0.5 mL/min左右较适宜。

图5 上样流速对吸附通量的影响Fig.5 Effect of sample flow velocity on adsorption capacity

2.3.2 上样浓度对吸附量的影响

控制上柱速率为0.5 mL/min，考察不同上样料液浓度下的动态吸附量，结果见图6。

由结果可知，AB-8吸附麦芽原花青素的能力随着上样浓度的提高而增加。当料液浓度为0.57 mg/mL时，湿AB-8树脂对麦芽原花青素的动态吸附量为5.72 mg，当料液浓度上升到0.96 mg/mL时，吸附量为7 mg。表明一定范围内原花青素的进样浓度越高，树脂的吸附量越大。但原花青素浓度处于较高水平时，与之竞争吸附的杂质量也增加，原花青素在树脂内部的扩散能力会降低，将加重浓缩工艺负荷，造成由浓度过高引起的上样困难，同时增大控制其他上样条件恒定的难度。而且由于原花青素上柱吸附前需要静置澄清，静置沉淀后原花青素浓度越高，沉淀过程中的损失越多［15］，所以上样时原花青素不宜采用较高浓度。选择上柱料液浓度在0.57 mg/mL。

图6 上样浓度对吸附量的影响Fig.6 Effect of sample concentration on adsorption capacity

2.4 AB-8大孔吸附树脂动态解吸附条件确定

2.4.1 洗脱剂浓度的选择

在已经确定的动态吸附条件下，洗脱流速1 mL/min，洗脱体积70 mL，考察洗脱剂乙醇浓度对洗脱效果的影响，结果如图7，图8所示。

图7 乙醇浓度对洗脱效果的影响Fig.7 Effect of ethanol concentration on desorption properties

图8 不同乙醇浓度AB-8树脂动态解吸曲线Fig.8 Elution curve of procyanidins absorbed on AB-8 resin with different ethanol concentration

如图7所示，随着乙醇浓度的增加，麦芽原花青素的解吸效率有所增加，50%，60%，70%(v/v)乙醇解吸回收率分别为:93.6%，95.2%和95.9%。可以看到60%乙醇已经有较高的回收率，且如图8所示，低浓度乙醇洗脱时的洗脱曲线有拖尾现象，洗脱不完全，50%和70%乙醇的解吸曲线峰形集中，无拖尾现象。但是洗脱剂乙醇浓度逐渐增加的同时，洗脱过程中柱体中产生的气泡也会增加，影响洗脱效果，综合考虑选择60%乙醇作为洗脱剂浓度。

2.4.2 洗脱流速的选择

在已经确定的动态吸附条件下，60%乙醇作为洗脱剂，洗脱体积70 mL，考察洗脱流速对洗脱效果的影响。实验结果如图9所示。

图9 洗脱流速对洗脱效果的影响Fig.9 Effect of desorption velocity on desorption properties

由图9可知，洗脱流速对洗脱效果有一定影响，洗脱效果随洗脱流速的提高总体呈下降趋势，这是流速对洗脱剂与吸附在大孔树脂上的多酚类物质交换产生的影响。洗脱速度过快，洗脱剂来不及与被吸附的原花青素充分作用，使得洗脱效率下降。综合考虑洗脱效率和操作时间，采用1 mL/min的流速。

2.4.3 洗脱液体积的选择

按已确定吸附条件吸附，60%乙醇作为洗脱剂，洗脱流速1 mL/min，洗脱剂用量对解吸效果的影响如图10所示。

图10 洗脱液乙醇体积对洗脱效果的影响Fig.10 Effect of elution ethanol volume on desorption properties

由图10可知，65 mL时原花青素基本完全洗脱。因此，从节约成本和减少浓缩负担出发，洗脱剂用量确定为65 mL。

2.5 麦芽和酒花中原花青素含量比较

为进一步研究啤酒中原花青素的组成与性质，根据已经确定的麦芽原花青素提取纯化条件，并且利用本实验室已经建立的酒花中原花青素提取纯化方法，进行有机溶剂萃取，再经过AB-8大孔吸附树脂纯化富集。对2种麦芽，3种酒花中的原花青素含量进行了比较，结果如图11所示。

图11 不同种类麦芽和酒花原花青素含量比较Fig.11 Comparison of procyanidins from different malt and hops

由结果可知，多酚颗粒酒花的原花青素总含量最多(37.71 mg/g)，这与酒花的制作工艺有关，多酚颗粒酒花富集了多酚的含量，所以原花青素含量较高，青岛大花和扎一香花的原花青素含量分别为29.14 mg/g和28.01 mg/g，没有明显差别。而3种酒花中原花青素含量均明显高于国产麦芽(1.88 mg/g)和进口澳麦(2.34 mg/g)，其中进口澳麦原花青素含量略高于国产麦芽，差别不明显。但在啤酒酿造过程中，原料酒花的添加量很少，成品啤酒中原花青素类物质有70%仍来源于麦芽。

3 结论

通过对进口澳麦中原花青素的提取纯化条件研究，建立了麦芽中原花青素有机溶剂提取最佳条件为:60%乙醇，提取温度为85℃，此时乙醇处于沸腾状态，料液比1∶25，提取时间为1.5 h。并利用AB-8大孔吸附树脂进行进一步层析纯化，装柱体积为13 mL，得到动态吸附条件:样品浓度0.57 mg/mL，上样流速0.5 mL/min，动态解吸条件:65 mL 60%乙醇在洗脱流速1 mL/min下洗脱，可得最佳洗脱效果。此时回收率可达95.2%，所得原花青素样品干基百分含量(纯度)可达67.58%。

对2种麦芽3种酒花中原花青素含量进行比较，多酚颗粒酒花的原花青素总含量最多，为37.71 mg/g，其次是青岛大花和扎一香花，原花青素含量分别为29.14 mg/g和28.01 mg/g，两者没有明显差别。3种酒花中原花青素含量均明显高于国产麦芽(1.88 mg/g)和进口澳麦(2.34 mg/g)，其中进口澳麦原花青素含量略高于国产麦芽，差别不明显。

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