陈明珍，谭书明

1(贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳，550025)2(贵州大学生命科学学院，贵州贵阳，550025)

3(贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州贵阳，550025)

糟辣椒(Pickling Pepper)是湖南、贵州等地区备受欢迎的传统调味品。糟辣椒在生产和储藏过程中很容易受到污染变质，出现胀袋、胀罐的现象［1］，主要是糟辣椒中微生物的大量繁殖所致，包括细菌、霉菌、酵母菌［2-4］。因此，需要选择合适方法来抑制微生物的生长繁殖，延长货架期。

目前，国家允许在酱腌菜中添加苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢醋酸钠、尼泊金酯钠等几种防腐剂［5-8］，传统工艺中对糟辣椒的保藏技术主要是在糟辣椒发酵过程中添加单一的食品防腐剂:谢田［8］在糟辣椒发酵前分别加入脱氢醋酸钠和苯甲酸钠作对比实验，发现均有一定的抑菌效果;李达［9］在糟辣椒发酵前加入壳聚糖对乳酸菌的生长繁殖有一定的抑制作用。由于不同防腐剂的抑菌原理各不相同，可想而知进行防腐剂的复配使用，效果要比单独使用好［10］。因此，本实验选择脱氢醋酸钠、苯甲酸钠、山梨酸钾，对前期从糟辣椒中分离鉴定出的13种腐败菌进行最低抑菌浓度(MIC)的测定和抑菌直径实验，确定每种防腐剂的用量范围和典型菌的选择。利用响应面方法对复合防腐剂配方进行优化，在不改变工厂传统的糟辣椒发酵工艺的情况下，对已发酵好的糟辣椒进行保藏技术研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种:从糟辣椒中分离出的13种腐败菌，其中细菌10种、霉菌2种、酵母菌1种，分别标号为X1发酵乳杆菌、X2马尿片球菌、X3耐酸乳杆菌、X4同型腐酒乳杆菌、X5消旋乳酸芽孢杆菌、X6植物乳杆菌、X7食糖乳杆菌、X8米酒乳杆菌、X9弯曲乳杆菌、X10嗜热释放芽孢杆菌、M1青霉属、M2毛霉属、J1酵母菌。防腐剂:脱氢醋酸钠(食品级)，郑州超群化工产品有限公司;苯甲酸钠(食品级)，山东渊智化工有限公司;山梨酸钾(食品级)，郑州皇朝化工产品有限公司。培养基:营养琼脂培养基，虎红培养基，PDA培养基。

1.2 仪器和设备

超净工作台SW-CJ-IFD苏州市华宇净化设备有限公司;恒温培养箱SPX-150B-I上海博迅实业有限公司医疗设备厂;立式压力蒸汽灭菌锅LS-875L-I江阴滨江医疗设备有限公司;分析天平BSA124S合肥汇联电子有限公司;电热鼓风干燥箱101-3A天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 实验内容与方法

1.3.1 菌悬液的制备

参照王向阳［11］的方法稍作修改，将细菌、霉菌分别接种在牛肉膏蛋白胨培养液、马铃薯葡萄糖培养液中，再分别置于37℃、27℃ 150 r/min的摇床上培养18 h(酵母菌的菌悬液的制备与霉菌相同)，再按照GB/4789.2-2010［12］中的计算公式计算出所配菌悬液的活菌数，将菌悬液调配成105CFU/mL，于4℃的冰箱中保存。

1.3.2 防腐剂溶液的配制

采用微量稀释法，根据 GB/2760-2011［13］中的要求，脱氢醋酸钠、苯甲酸钠、山梨酸钾的最大使用量分别为0.3、1、0.5 g/kg。将定量的防腐剂溶解于无菌水中，再将试剂分别以以下8种梯度加入相应的培养基中，见表1。

表1 防腐剂的浓度梯度Table 1 The concentration gradient of Preservatives

1.3.3 典型菌的选取

采用测定MIC值的方法，选取对防腐剂反应迟缓的、生长显著的作为复配防腐剂选择的典型菌。

1.3.4 响应面的优化

同一功能的食品添加剂(相同色泽着色剂、防腐剂、抗氧化剂)在混合使用时，各自用量占其最大使用量的比例之和不应超过1［13］。根据3种防腐剂对13种腐败菌的MIC值的平均值结果，来选取合适的浓度。采用3因素3水平的Box-Behnken的设计对脱氢醋酸钠(A)、苯甲酸钠(B)、山梨酸钾(C)进行复配，以抑菌圈直径为响应值，确定3种防腐剂的最优配比。试验因素编码和水平见表2。

表2 Box-Behnken响应面设计试验因素水平和编码Table 2 Response surface of experimental factor levels

1.3.5 测定的方法

1.3.5.1 MIC值的测定

在无菌条件下，将防腐剂添加于培养基中，待培养基凝固后加入0.1 mL的菌悬液，均匀涂布置于的恒温培养箱中培养并观察(细菌用营养琼脂培养，霉菌和酵母菌用虎红培养基)。细菌菌悬液置于37℃下培养2 d，霉菌菌悬液置于27℃下培养3 d，酵母菌悬液置于27℃下培养3 d。以不加防腐剂的为空白对照组，以培养基平板上完全无菌生长时的防腐剂浓度为 MIC［14］。

1.3.5.2 抑菌圈直径的测定

参照吴影［15］的方法，将滤纸用打孔器打成6 mm的大小，灭菌后在相应的防腐剂溶液中浸泡40 min后，将其放在已涂布了待测菌的相应的培养基平板中，细菌培养2 d，霉菌和酵母菌培养4 d后测定其抑菌圈的直径:d=d1-d2

d1:添加防腐剂的抑菌圈直径;d2:空白组抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 典型菌的确定

不同防腐剂对糟辣椒中的腐败菌的抑菌效果和差异显著性结果如图1所示。

图1 三种防腐剂对腐败菌的MIC值Fig.1 MIC’s of three preservatives against typical spoilage bacteria

从图1可以看出，脱氢醋酸钠、苯甲酸钠、山梨酸钾对13种腐败菌的抑菌效果各不相同。对于这3种防腐剂的MIC进行显著性分析可以看出:脱氢醋酸钠对 X1、X3、X5、X7的抑制作用最强，对 X2、X9的抑制作用最弱;苯甲酸钠对X6、M2的抑制作用最强，对X8、M1有较强的抑制作用，对 X2、X3、X5、X9、X10有较弱的抑制作用;山梨酸钾对M1、M2的抑制作用最强，对 X3、X6、X8、X10有较强的抑制作用，对 X2、X9的抑制作用最弱。可以看出:3种防腐剂对X2、X9的MIC值最大，因此选择X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌作为防腐剂复配试验的典型菌。

2.2 响应面设计结果与分析

以菌X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌为试验菌进行响应面的优化实验，以抑菌圈直径为响应值，利用Design-Expert7.0软件进行回归分析，实验结果见表3。

表3 响应面实验响应值结果Table 3 The response value results of response surface experimental

2.2.1 X2马尿片球菌抑菌圈直径回归方程的确定

由表4可知，模型的一次项A(脱氢醋酸钠)、C(山梨酸钾)都显著(P＜0.05)，B(苯甲酸钠)极显著(P ＜0.01)，二次项 A2、C2显著(P ＜0.05)，B2显著(P＜0.01)，交互项AB极显著(P＜0.01)，BC显著(P ＜0.05)。

表4 X2马尿片球菌抑菌圈直径回归模型方差分析Table 4 Variance analysis for Bacteriostatic circle diameter of X2Pediococcus urinae-equi

所选模型不同配比间的差异极显著(P=0.001 5＜0.01)，说明模型间的变量和响应值之间存在着极显著的线性关系。失拟项P=0.7827＞0.05，没有显著性差异，说明试验数据无异常点，误差较小;复相关系数的平方为0.941 6，说明拟合程度很好，实验误差较小。=0.866 5，说明建立的模型能够解释86.65%响应值的变化，能够很好的反映出抑菌圈的直径随着防腐剂添加量不同的变化规律，可以对实验结果进行分析和预测。对表中所得的数据进行多元回归拟合，通过分析得A、B、C与X2马尿片球菌抑菌圈直径之间的二次多项式模型为:

X2马尿片球菌的抑菌圈直径=6.47+0.23A+0.45B+0.20C-0.39AB-0.085AC-0.26 BC-0.28A2-0.38B2-0.25C2

式中:A、B、C分别代表不同防腐剂的编码值。

2.2.2 X9弯曲乳杆菌抑菌圈直径回归方程的确定

由表5可知，模型的一次项C(山梨酸钾)显著(P＜0.05)，A(脱氢醋酸钠)、B(苯甲酸钠)极显著(P ＜0.01)，二次项 A2、B2、C2极显著(P ＜0.01)，交互项AB、BC显著(P＜0.05)。

表5 X9弯曲乳杆菌抑菌圈直径回归模型方差分析Table 5 Variance analysis for Bacteriostatic circle diameter of X9Lactobacillus curvatus

所选模型不同配比间的差异极显著(P＜0.000 1＜0.01)，说明模型间的变量和响应值之间存在着极显著的线性关系。失拟项0.913 8＞0.05，不显著，说明试验数据无异常点;复相关系数R2=0.974 7，说明该模型拟合程度好。，说明建立的模型能够解释94.21%响应值的变化。因此确定可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。对表中所得的数据进行多元回归拟合，通过分析得A、B、C与X9弯曲乳杆菌抑菌圈直径之间的二次多项式模型为:

X9弯曲乳杆菌抑菌圈直径=6.65+0.31A+0.42B+0.18C-0.21AB-0.077AC-0.22 BC-0.53A2-0.65B2-0.36C2

式中:A、B、C分别代表不同防腐剂的编码值。

2.3 不同因素的交互作用分析

根据回归方程绘制A(脱氢醋酸钠)、B(苯甲酸钠)、C(山梨酸钾)3个因素对响应值的响应面图和等高线图。

2.3.1 A(脱氢醋酸钠)和B(苯甲酸钠)交互后最佳抑菌值的确定

从图2可以看出，A(脱氢醋酸钠)、B(苯甲酸钠)之间的交互作用达到显著水平。将C(山梨酸钾)固定在零水平，可以得到A(脱氢醋酸钠)、B(苯甲酸钠)对X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的影响方程分别为:

X2=6.36+0.23A+0.45B-0.39AB-0.30 A2-0.40B2

X9=6.50+0.31A+0.42B-0.21AB-0.55A2-0.67B2

可以看出，随着A和B添加量的增加，X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的抑菌圈直径也增加，但是A和B添加量过高都不利于对X2和X9的抑制，所以A(脱氢醋酸钠)为0.1 mg/mL，B(苯甲酸钠)为0.22 mg/mL在，X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的抑菌圈直径最大。

图2 A(脱氢醋酸钠)和B(苯甲酸钠)响应面和等高线图Fig.2 Response surface and contour plot showing the interactive effects of sodium acetate and sodium benzoate

2.3.2 A(脱氢醋酸钠)和C(山梨酸钾)交互后最佳抑菌值的确定

从图3可以看出，A(脱氢醋酸钠)和C(山梨酸钾)之间的交互作用不显著。将B(苯甲酸钠)固定在零水平，可以得到A(脱氢醋酸钠)和C(山梨酸钾)对X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的影响方程分别为:

X2马尿片球菌 =6.31+0.23A+0.20C-0.085AC-0.30A2-0.27C2

X9弯曲乳杆菌 =6.37+0.31 A+0.18C-0.077AC-0.57A2-0.39C2

同时，随着A(脱氢醋酸钠)和C(山梨酸钾)添加量的增加，X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的抑菌圈直径也增加，但是A(脱氢醋酸钠)和C(山梨酸钾)添加量过高都不利于对X2马尿片球菌、X9弯曲乳杆菌的抑制，所以A(脱氢醋酸钠)为0.1 mg/mL，C(山梨酸钾)为0.14 mg/mL时，X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的抑菌圈直径最大。

图3 A(脱氢醋酸钠)和C(山梨酸钾)响应面和等高线图Fig.3 Response surface and contour plot showing the interactive effects of sodium acetate and potassium sorbate

2.3.3 B(苯甲酸钠)和C(山梨酸钾)交互后最佳抑菌值的确定

从图4可以看出，B(苯甲酸钠)和C(山梨酸钾)之间的交互作用达到显著水平。将A(脱氢醋酸钠)固定在零水平，可以得到B(苯甲酸钠)和C(山梨酸钾)对X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的影响方程分别为:

X2马尿片球菌 =6.35+0.45B+0.20C-0.26BC-0.40B2-0.27C2

X9弯曲乳杆菌 =6.42+0.42B+0.18C-0.22BC-0.68B2-0.39C2

同时，随着B(苯甲酸钠)和C(山梨酸钾)添加量的增加，X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的抑菌圈直径也增加，但是B(苯甲酸钠)和C(山梨酸钾)添加量过高都不利于对X2马尿片球菌、X9弯曲乳杆菌的抑制，所以B(苯甲酸钠)为0.22 mg/mL，C(山梨酸钾)为0.14 mg/mL时，X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的抑菌圈直径最大。

2.3.4 模型的优化和验证

通过分析可以得到最佳的工艺参数为:A(脱氢醋酸钠)、B(苯甲酸钠)和C(山梨酸钾)最佳添加量分别为0.1 mg/mL、0.22 mg/mL、0.14 mg/mL。做3组平行实验，得到X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的抑菌圈直径平均值分别为6.61 mm和6.73 mm，与理论预测值6.59 mm和6.75 mm非常接近，说明了该模型可以很好的预测防腐剂的量与抑菌圈直径的关系，同时证明响应面优化得到的最优配方的可行性。

3 结论

通过测定出A(脱氢醋酸钠)、B(苯甲酸钠)和C(山梨酸钾)3种防腐剂对糟辣椒中13种腐败菌的最低抑菌浓度MIC值，得到X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的繁殖能力和对这3种防腐剂的抗性均较强，为简化实验，以这两种菌作为典型菌进行响应面的优化实验。通过响应面法建立了A(脱氢醋酸钠)、B(苯甲酸钠)和C(山梨酸钾)与抑菌直径的回归模型:

X2马尿片球菌的抑菌圈直径=6.47+0.23A+0.45B+0.20C-0.39AB-0.085AC-0.26 BC-0.28A2-0.38B2-0.25C2

X9弯曲乳杆菌的抑菌圈直径=6.65+0.31A+0.42B+0.18C-0.21AB-0.077AC-0.22 BC-0.53A2-0.65B2-0.36C2

根据回归方程和实际情况，最终得到最佳配方的添加量为A(脱氢醋酸钠)0.1 mg/mL、B(苯甲酸钠)0.22 mg/mL、C(山梨酸钾)0.14 mg/mL，在最佳配方测得X2马尿片球菌和X9弯曲乳杆菌的抑菌圈直径分别为6.61 mm和6.73 mm，具有明显效果。

图4 B(苯甲酸钠)和C(山梨酸钾)响应面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plot showing the interactive effects of sodium benzoate and potassium sorbate

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