熊文飞，陈日春，，蔡一楠，郑宝东

1(福州市食品工业研究所，福建 福州，350013)2(福建农林大学食品科学学院，福建福州，350002)

胶原蛋白是动物皮、骨和肌腱等结缔组织中主要的结构蛋白，由于其具有很好的生物兼容性与降解性以及较弱的抗原性而被广泛应用于食品、药品和化妆品行业［1］。通常胶原蛋白都是从牛、猪以及家禽等陆生动物的加工副产物中提取，然而随着疯牛病、口蹄疫以及禽流感的爆发，引起了一些消费者对来自于陆生动物胶原蛋白及其相关制品的担忧，因此水产品作为一种新的胶原蛋白来源而被日益重视。

一般情况下，胶原蛋白都是以液体试剂的形式存在，胶原溶液一方面可以作为组织填充物［2］或药物载体而直接注射［3］，另一方面也可转化成诸如纤维、薄膜、海绵以及生物膜等形式的固体植入物［4-5］。无论胶原蛋白以何种形式应用，对其流变学特性的研究均非常重要，因为对胶原蛋白流变特性的认识能够帮助生产者控制或操纵相关胶原产品质量的优劣与稳定性［6］。国内外针对胶原蛋白流变特性的研究，先后有Amis等［7］分别通过对水和甘油中胶原蛋白黏度的测量研究了pH对其弹性的影响;Yoshimura等［8］探究了鲨鱼皮碱溶性与酶溶性胶原蛋白黏度特性的动力机制;Forgacs等［9］通过对胶原蛋白流变性的测定研究了胶原基质组件的溶胶-凝胶相转变;Lai等［10］系统地研究了牛皮胶原蛋白溶液的流变学特性，结果表明牛皮胶原蛋白为典型的假塑性流体;王海波等［11］研究了草鱼鱼鳞酸溶与酶溶性胶原蛋白的流变特性。本文以鲢鱼鱼鳞胶原蛋白为研究对象，重点考察剪切速率、浓度、温度等因素对其流体特性和黏弹性的影响，旨在为鲢鱼鱼鳞胶原蛋白的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

鲢鱼鱼鳞收集于福州市华林永辉超市，鱼鳞经冷水反复冲洗后低温风干保存于-18℃下备用;EDTA，由汕头市金砂化工厂有限公司提供;胃蛋白酶(1∶3 000)，由上海源聚生物科技有限公司提供;透析袋(截留分子量10 kDa)，由上海源叶生物科技有限公司提供;其他化学剂均为分析纯。

1.2 主要设备

AR1140电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;H2050R台式高速大容量冷冻离心机，湘仪离心机有限公司;LGJ-10D冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂;NDJ-8S数字式黏度计，上海尼润智能科技有限公司;MCR30高级流变仪，奥地利安东帕公司。

1.3 实验方法

1.3.1 胶原蛋白的提取

新鲜鱼鳞用冰纯水清洗除杂后，用EDTA溶液浸泡脱钙［12］，料液比(g∶mL)1∶30;脱钙后的鱼鳞于 0.1 mol/L NaOH溶液中浸泡6 h脱除非胶原蛋白，料液比(g∶mL)1∶8;将经脱钙和除去非胶原蛋白后的鱼鳞浸泡于0.5 mol/L乙酸溶液中，添加0.85%胃蛋白酶，液料比(g∶mL)1∶18，提取胶原蛋白;经 300 目滤布过滤得到胶原蛋白提取液，向提取液中添加NaCl至其浓度达0.9 mol/L，盐析24 h，然后离心获得胶原蛋白沉淀物，将沉淀物置于截留分子质量为10 kDa的透析袋中透析24 h，冻干即得胶原蛋白备用。

1.3.2 剪切速率对胶原蛋白溶液黏度的影响

剪切速率对胶原蛋白溶液流体特性的影响参考汪海波等［11］的方法略作修改。用蒸馏水配制不同质量浓度(0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%)的胶原蛋白溶液，采用MCR30高级流变仪测定溶液在不同剪切速率下不同溶液的黏度，测定条件:温度20℃，椎板40 mm，2°，测定采用流动模式，数据获取为连续模式，以剪切速率为变量，变量范围从1～1 000 s-1，变量扫描为线性模式，采集30个变量点。

1.3.3 温度对胶原蛋白溶液黏度的影响

用蒸馏水配制质量浓度为1.0%的胶原蛋白溶液，采用NDJ-8S数字式黏度计不同温度下不同浓度胶原蛋白溶液的黏度，测定条件为:零号转子，转速30 r/min，测定温度范围10～70℃，每隔5℃测定1次。

1.4 鲢鱼鱼鳞胶原蛋白溶液的黏弹性能

1.4.1 胶原蛋白溶液黏弹曲线的测定

胶原蛋白溶液黏弹曲线的测定参考Lai等［10］的方法略作修改。用蒸馏水配制质量浓度为1.0%的胶原蛋白溶液，采用MCR30高级流变仪测定其黏弹性曲线。测定条件:温度20℃，40 mm，2°椎板，在振荡模式下测定，采用频率扫描的数据获取模式，频率扫描范围从150～0.01rad/s，变量扫描为线性模式，采集30个变量点。

1.4.2 温度对胶原蛋白溶液黏弹性能的影响

温度对胶原蛋白溶液黏弹性能的影响参考Lai等［10］的方法略作修改。用蒸馏水配制质量浓度为1.0%的PSC溶液，采用MCR30高级流变仪测定其粘弹性曲线。测定条件:40 mm，2°椎板，平衡时间1 min，振荡测定模式，采集30个变量点，温度扫描范围从10～70℃，振荡频率为60 rad/s，数据获取模式为温度扫描模式。

1.5 统计分析

采用Origin8.0和DPS7.05分别对试验结果进行绘图和拟合。

2 结果与分析

2.1 剪切速率对胶原蛋白溶液黏度的影响

蛋白质溶液的黏度反映了它对流动的阻力，可用牛顿幂律方程来表示:

式中:η为表观黏度，Pa·s;k为浓度系数;γ为剪切速率，s-1;n为流动指数。

当n=1时，流体为牛顿流体;当n≠1时，流体为非牛顿流体，其中n＞1时，流体为胀塑性流体;n＜1时，流体为假塑性流体。

剪切速率对鲢鱼鱼鳞胶原蛋白溶液黏度的影响如图1所示。由图可知，随着胶原蛋白质量浓度的提高，其表观黏度也相应上升;当剪切速率较低时，表观黏度下降迅速，而表观黏度在较高剪切速率下下降缓慢，表观黏度随剪切速率的增加而降低的现象在流变学中称为剪切稀释。造成剪切稀释的原因主要是由于蛋白质分子在流动方向上逐步定向，因而摩擦阻力下降，另外蛋白质水化球在流动方向变性以及氢键和其他弱键的断裂导致蛋白质聚集体或网络结构的解体也会导致剪切稀释的发生［13］。剪切稀释现象是典型非牛顿流体特有的假塑性流动行为，表明不同质量浓度的胶原蛋白溶液均为假塑性流体，这与草鱼鱼鳞胶原蛋白［11］和牛皮胶原蛋白［10］的流体类型相同。

图1 剪切速率对胶原蛋白溶液粘度的影响Fig.1 Effect of shear rate on the viscosity of collagen solution

进一步对图1中曲线进行拟合，得到回归方程和相关系数如表1所示。由表1可知，各回归方程中n＜1，这进一步验证了胶原蛋白溶液为假塑性流体。随着胶原蛋白质量浓度的增加，回归方程中浓度系数和流动指数均呈现出上升趋势，且在高剪切速率下，胶原蛋白溶液有从假塑性非牛顿流体变为牛顿流体的趋势。此外各回归方程的相关系数均大于0.950 0，说明拟合值与实测值吻合很好，回归方程有效。

表1 不同浓度胶原蛋白溶液的牛顿幂律方程Table 1 Newtonian power-law equation of different collagen solution

2.2 温度对胶原蛋白溶液黏度的影响

温度对鲢鱼鱼鳞胶原蛋白溶液(1.0%)黏度的影响如图2所示。随着温度的上升，胶原蛋白溶液表观粘度持续下降;相比较而言，温度较低时表观黏度的下降更为迅速;当温度由20℃上升到25℃过程中，表观黏度出现了一个骤然下降的突变段，这是由于胶原蛋白受热变性所致。

图2 温度对胶原蛋白溶液黏度的影响Fig.2 Effect of temperature on the viscosity of collagen solution

温度对流体溶液黏度的影响可用阿罗尼乌斯方程方程来描述:

式中:η为溶液表观黏度;k为常数;Ea为活化能;R为气体常数;T绝对温度，K。

采用DPS7.05数据分析软件对试验结果进行分段拟合和回归分析，结果如表2所示。活化能随着温度的增加而逐渐上升，这说明随着温度的增加，胶原蛋白溶液流动所需要的能量增加。且各回归方程的相关系数R均大于0.910 0，说明拟合值与实测值吻合很好，回归方程有效。

表2 胶原蛋白溶液的阿罗尼乌斯方程Table 2 Arrhenius equation of collagen solution

2.3 胶原蛋白溶液黏弹曲线的测定

通常用振荡模型来测定高聚物的黏弹性能，即对高聚物分子施加一个扭摆力矩，使高聚物在此力矩下发生运动。高聚物的黏弹性能可用Maxwell力学模型来描述:

式中:G*为动态模量或绝对模量，Pa;G＇为储存模量或弹性模量，Pa;G″为损耗模量或黏性模量，Pa。

其中G＇反映了高聚物随外力的改变而发生形变的能力，而G″则反映了高聚物在外力作用发生改变时分子链内部或分子间拉伸导致的能量损耗。高聚物在振荡运动中的力学损耗可用正切损耗角 tanδ随振荡频率变化的改变来表示［14］:

鲢鱼鱼鳞胶原蛋白溶液(1.0%)的黏弹曲线如图3所示。当振荡频率小于20 rad/s时，黏性模量G″大于弹性模量G＇，tanδ大于1，胶原蛋白溶液主要表现为黏性行为;当振荡频率大于20 rad/s时，黏性模量G″小于弹性模量G＇，tanδ小于1，胶原蛋白溶液主要表现为弹性行为。这与草鱼鱼鳞胶原蛋白在整个振荡频率范围内主要表现为黏性行为(tanδ大于1)，基本不具备凝胶的弹性特征不同［11］。

图3 胶原蛋白溶液黏弹曲线(20℃，1.0%)Fig.3 Visco-elastic curve of collagen solution(20℃，1.0%)

2.4 温度对胶原蛋白溶液黏弹性能的影响

温度对鲢鱼鱼鳞胶原蛋白溶液黏弹性能的影响如图4所示。

图4 温度对胶原蛋白溶液(1.0%)黏弹曲线的影响Fig.4 Effect of temperature on the visco-elastic curve of collagen solution(1.0%)

从图4可以看出，在胶原蛋白变性温度附近，胶原蛋白溶液的弹性模量G'和黏性模量G″均出现突跃现象;而在经过变性温度区间之后，弹性模量G'基本保持不变，黏性模量G″逐渐下降，这表明鲢鱼鱼鳞胶原蛋白发生热变性之后，其流体的弹性行为基本不变而黏性行为下降，这与草鱼鱼鳞胶原蛋白受温度的影响结果略有不同［11］。

3 结论

鲢鱼鱼鳞胶原蛋白溶液为典型假塑性流体，即溶液黏度随剪切速率的增加而减小，且其流变特性均符合牛顿幂律方程。剪切速率、浓度和温度对胶原蛋白溶液的黏度影响较大，且阿罗尼乌斯方程能够很好地表达温度对黏度影响。当振荡频率小于20 rad/s时，鲢鱼鱼鳞胶原蛋白溶液(1.0%)主要表现为黏性行为;当振荡频率大于20 rad/s时，鲢鱼鱼鳞胶原蛋白溶液(1.0%)主要表现为弹性行为。温度对鲢鱼鱼鳞胶原蛋白溶液(1.0%)黏弹性能的影响显著，胶原蛋白发生热变性之后，其流体的弹性行为基本不变而黏性行为下降。

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