杨阳，陈雪峰，李蕊岑

(陕西科技大学，生命科学与工程学院，陕西西安，710021)

膳食纤维被称为第七大营养素，对人体生理功能具有重要作用。膳食纤维发挥生理功能的显著性与水溶性膳食纤维(SDF)和水不溶性膳食纤维(IDF)比例有很大关系，为提高SDF比例，可对膳食纤维挤压改性，通过高温高剪切作用使部分糖苷键断裂，从而使得部分IDF转变成SDF，提高SDF构成比例。苹果渣中含有丰富的膳食纤维，可作为提取膳食纤维的资源。

SDF的组成成分主要为果胶、半乳甘露聚糖及葡聚糖等。研究发现，对多糖进行适当结构修饰可以改善其生物活性［1］，如对某些多糖酯化修饰后，可提高其抗凝血、抗病毒、抗氧化等活性［2-4］。目前多糖的硫酸酯化方法也有多种，如氯磺酸-吡啶法，浓硫酸法，三氧化硫-吡啶法［5-6］。本研究选用氨基磺酸作为酯化剂，以硫酸基取代度(DS)为衡量指标，通过正交试验优化了最佳酯化工艺条件，并对其产物进行红外光谱分析，以期为苹果渣SDF的生物活性改造技术探讨新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

苹果渣，陕西省海升果业发展股份有限公司乾县分公司。

1.2 试剂与仪器

体积分数35%双氧水、NaOH、体积分数95%乙醇、K2SO4、氨基磺酸、吡啶、BaCl2、明胶、NaCl等其他试剂均为分析纯。

单螺杆挤压机，实验室自行组装;BS323S电子天平，赛多斯科学仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司;H-1850R离心机，长沙湘仪离心机器有限公司;101-1AB型电热鼓风干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司;高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司;VECTOR22傅立叶变换红外光谱仪，德国BRUKER公司。

1.3 样品处理

采用高速万能粉碎机对苹果渣进行粉碎，控制粉碎时间为20 s。将粉碎后物料过筛，取20目苹果渣收集备用。

1.4 苹果渣脱色

称取一定量20目粉碎果渣，按照1∶8(g∶mL)料液比加入蒸馏水，以3 mol/L NaOH溶液调节pH值为13.0。加入蒸馏水体积2%的H2O2，于70℃水浴条件下反应2 h，以流水冲洗将果渣洗涤至中性，70℃烘箱中干燥。

1.5 苹果渣挤压改性

将脱色后苹果渣用单螺杆挤压机进行挤压处理，挤压条件为:物料粒度20目，加水量为苹果渣干重质量的40%，螺杆转速720 r/min。经一定时间挤压处理后，物料于50℃烘箱干燥5 h，得挤压改性后苹果渣，备用。

1.6 水溶性膳食纤维(SDF)提取

称取一定量挤压改性后苹果渣，以1∶25(g∶mL)料液比加入蒸馏水，搅拌后于60℃水浴处理1 h，抽滤并收集滤液，加入4倍苹果渣体积的95%乙醇提取，静置12 h后抽滤，所得物质于70℃烘箱中干燥，即得苹果渣SDF。

1.7 水溶性膳食纤维硫酸酯化修饰

1.7.1 硫酸根标准曲线绘制［7］

准确称取108.75 mg K2SO4于105℃干燥至恒重，以1 mol/L HCl溶液溶解后定容至100 mL，得到0.6 mg/mL K2SO4标准溶液，分别吸取K2SO4标准溶液 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mL于具塞试管中，以1mol/L HCl溶液补至0.2mL，以1 mol/L HCl溶液为空白，加入3.8 mL三氯乙酸及1 mL氯化钡-明胶溶液，混合均匀后反应15 min，在360 nm下测定吸光度值A1，再以1 mL明胶溶液代替氯化钡-明胶溶液继续上述操作，得到吸光度 A2，以 SO2-4质量(mg)为横坐标，(A1-A2)为纵坐标绘制标准曲线。

1.7.2 酯化修饰

精确称取0.3 g挤压改性SDF于100 mL烧杯中，加入一定量吡啶，磁力搅拌器升至所需温度后搅拌溶解，加入一定量氨基磺酸继续搅拌至反应结束。反应完毕后冷却至室温，以2.5 moL/L NaOH溶液调节至pH 7.0～7.5，将反应液移入透析袋中，用蒸馏水进行透析。透析结束后对透析液加入3倍体积的体积分数95%乙醇，静置12 h，以10 000 r/min离心透析液15 min，去除清液，沉淀物置于70℃水浴中将乙醇挥发干净，干燥后即得到硫酸酯化产物。得到产物以硫酸钡比浊法对其取代度进行测定［8］。

1.7.3 反应温度对硫酸酯化修饰取代度的影响

按照上述试验方法，调节反应温度为40、50、60、70、80、90 ℃，固定酯化时间为3 h，SDF∶氨基磺酸(g∶g)比例为 1∶3，氨基磺酸∶吡啶(g∶mL)比例为 1∶20，测定不同酯化温度下硫酸酯化产物取代度。

1.7.4 反应时间对硫酸酯化修饰取代度的影响

按照1.7.2试验方法，调节反应时间为1、2、3、4、5 h，固定酯化温度为 70℃，SDF∶氨基磺酸(g∶g)比例为1∶3，氨基磺酸∶吡啶(g∶mL)比例为 1∶20，测定不同酯化时间下硫酸酯化产物取代度。

1.7.5 挤压改性SDF∶氨基磺酸比例对硫酸酯化修饰取代度的影响

按照1.7.2试验方法，调节SDF∶氨基磺酸比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，固定酯化温度 70 ℃，反应时间 3 h，氨基磺酸:吡啶(g∶mL)比例 1∶20，测定不同挤压改性SDF∶氨基磺酸(g∶g)比例硫酸酯化产物取代度。

1.7.6 氨基磺酸：吡啶比例对硫酸酯化修饰取代度的影响

按照1.7.2试验方法，调节氨基磺酸:吡啶比例为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，固定酯化温度为70℃，反应时间3 h，挤压改性SDF:氨基磺酸(g∶g)比例为1∶3，测定不同氨基磺酸:吡啶(g∶mL)比例下硫酸酯化产物取代度。

1.7.7 挤压改性SDF硫酸酯化修饰正交试验

在单因素实验基础上，选取反应温度(A)、酯化时间(B)、SDF∶氨基磺酸(g∶g)(C)、氨基磺酸∶吡啶(g∶mL)(D)为因素，以硫酸根取代度为指标确定四因素三水平正交试验(表1)，以得到最佳酯化条件。

表1 硫酸酯化修饰正交试验因素及水平Table 1 Sulfation modified orthogonal factors and levels

1.8 红外光谱分析

取挤压改性SDF及其硫酸酯化修饰样品，研磨过100目筛后进行傅里叶红外光谱扫描，扫描范围为4 000～400 cm-1。得到红外光谱曲线进行分析。

2 结果与分析

2.1 硫酸根标准曲线

根据1.4.2试验方法得到硫酸根标准曲线，所得回归方程为y=0.996x+0.006 7，R2=0.991 2，表明K2SO4在0.012～0.12 μg内线性关系良好。

2.2 反应温度对硫酸酯化修饰取代度的影响

由图1可以看出，70℃时，酯化度高达1.02，低于70℃时，随着温度升高，酯化度逐渐增大，但当温度高于70℃时，酯化度开始下降。这可能是因为挤压改性后的SDF在高温及酸性环境下，部分低聚糖等发生分解，使得酯化程度降低。

图1 反应温度对取代度的影响Fig.1 The effect of reaction temperature on DS

2.3 反应时间对硫酸酯化修饰取代度的影响

由图2可以看出，当其他条件一定，反应时间为3 h时，取代度最高，可达0.78，挤压改性SDF的酯化度随着时间的增加先升高后降低。可能是由于氨基磺酸的酸性环境导致酯化时间过长引起部分糖降解。同时酯化时间过长也会增加经济成本，效率降低。

图2 反应时间对取代度的影响Fig.2 The effect of reaction time on DS

2.4 SDF与氨基磺酸质量比对硫酸酯化修饰取代度的影响

由图3可以看出，挤压改性SDF∶氨基磺酸的比例(g∶g)影响其酯化度，在一定比例范围内，随着底物比例的增加，酯化度不断增大，当比例为1∶3时，酯化度达到最大，随后酯化度开始降低，其原因可能在于氨基磺酸对反应体系提供酸性环境，当酸性环境过大时，引起了糖的降解。

图3 挤压改性SDF:氨基磺酸比例(g∶g)对硫酸酯化修饰取代度的影响Fig.3 The effect of the mass ratio of extrusion modified SDF and amino acid on DS

2.5 氨基磺酸∶吡啶比例(g∶mL)对硫酸酯化修饰取代度的影响

由图4可以看出，随着氨基磺酸与吡啶比例增大，酯化度逐渐增大，当氨基磺酸与吡啶的料液比为1∶40时，酯化修饰结果最好，取代度达到0.81，另外吡啶由于其恶臭味及毒性，因此比例不宜过大。

图4 氨基磺酸∶吡啶比例(g∶mL)对硫酸酯化修饰取代度的影响Fig.4 The effect of mass volume ratio of amino acid and pyridine on DS

2.6 硫酸酯化SDF正交实验结果

以取代度(DS)为指标的方差分析显示，4因素的影响程度依次为A＞B＞C＞D，即反应温度＞反应时间＞SDF∶氨基磺酸(g∶g)比例＞氨基磺酸∶啶(g∶mL)比例，从表2中的k1、k2、k3来看，挤压改性SDF硫酸酯化修饰的最佳组合为 A1B2C2D2，即反应温度60℃，反应时间3 h，挤压改性SDF:氨基磺酸(g∶g)比例为1∶3，氨基磺酸:吡啶(g∶mL)为 1∶30，在该工艺条件下进行酯化反应取代度达到1.18。方差分析结果显示，反应温度F比为10.200，大于F临界值9.000，因此因素反应温度是显著的。

表2 硫酸酯化修饰正交试验结果Table 2 The results of sulfation modified orthogonal test

2.7 硫酸酯化SDF红外光谱分析

硫酸酯化修饰前后的挤压改性SDF红外光谱分析结果如图5显示，经过酯化修饰后，1 228.62 cm-1处出现S＝O伸缩振动吸收峰，813.93 cm-1处出现C—O—SO3吸收峰。这2个峰均为硫酸基特征吸收峰，它们的出现表明硫酸基已成功结合在挤压改性SDF上。

图5 硫酸酯化修饰前后红外光谱图Fig.5 FTIR spectra of sulfated before and after modification

3 讨论

对挤压改性后的苹果渣SDF进行硫酸酯化修饰，在单因素试验基础上设计4水平3因素正交试验，得到最佳酯化工艺参数为:反应温度60℃，反应时间3 h，挤压改性 SDF∶氨基磺酸(g∶g)比例为1∶3，氨基磺酸∶吡啶(g∶mL)为 1∶30，该条件下，取代度达到1.29。王莉等［9］采用氯磺酸-吡啶合成硫酸酯化米糠多糖，结果显示最佳条件下合成酯化多糖取代度为1.29。张萍等［10］采用氨基磺酸-吡啶法合成赤灵芝硫酸酯化多糖，取代度达到1.21。李公斌等［11］采用氯磺酸-吡啶法合成黑木耳硫酸酯化多糖，取代度可达0.93。本研究结果与其他研究中不同种类酯化多糖的结果较为类似。红外光谱显示，硫酸酯化修饰后的多糖链中已成功引入硫酸基。对于酯化修饰后的SDF抗氧化活性、对机体免疫性及其他生物活性研究将在今后进行进一步研究。本研究选用酯化剂为氨基磺酸，该酯化剂具有不挥发、无臭味、对人体毒性极小的优点，相比常用的酯化剂如氯磺酸、三氧化硫等更为安全。

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