周志磊，徐志强，周顺，汪华，徐菲菲，李玥，钟芳

1(江南大学食品学院，江苏 无锡，214122)2(安徽中烟工业公司技术中心，安徽合肥，230088)

美拉德反应是还原糖与含氮物质(氨基酸、肽和蛋白质等)间发生的一种非酶棕色化学反应，它包括一系列复杂的反应并产生大量的香味物质和色素等成分［1-2］。美拉德反应在形成和改善食品色泽和风味中占有重要地位，美拉德反应产物具有抗氧化、金属螯合以及生物活性［3-4］。

研究人员常使用氨基酸还原糖混合物的简单模型代替食品来研究美拉德反应中香味物质及色素的形成［5］。美拉德反应可以在液相或者固相中进行，液相反应模型可以模拟蒸煮或者湿热杀菌等过程中的美拉德反应，而固相反应模型代表了烘焙、烧烤以及卷烟燃烧等条件下的反应过程。在可以对比的条件下固相和液相美拉德反应的反应时间和产物数目有明显差异，但是不同相中美拉德反应产物的形成机理基本上是一样的［6］，这有助于人们分析一些具体产物的形成机理。

脯氨酸美拉德反应产生的烧烤特征香味对许多需要进行热处理的食品风味有重要贡献［7］，一些研究人员分析了脯氨酸美拉德反应中重要的香味物质［8］。但是，这些研究大多是在液相中进行的。因此本文探讨了固相葡萄糖果糖与脯氨酸的美拉德反应中焦甜香香味物质的形成，并分析了它们的形成机理。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1水合 D-葡萄糖 (C6H12O6·H2O)、D-葡萄糖(C6H12O6)、D-果糖和 L-脯氨酸(Proline)、乙酸苯乙酯(内标)、2-糠醇、2-乙酰呋喃、5-甲基-2-糠醇、4-羟基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)、无水硫酸钠和正构烷烃(C7～C15)为分析纯，购自百灵威科技有限公司(北京，中国)。溶剂(CH2Cl2)为色谱纯，购自Tedia公司(费尔菲尔德，美国)。

气相色谱-质谱联用仪6890-5975C，安捷伦科技有限公司;旋转蒸发仪:R-215，瑞士Buchi公司;超声仪KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型反应与样品制备

取1mmol的1水合D-葡萄糖、D-葡萄糖或者D-果糖与1mmol的L-脯氨酸混合并在研钵中充分研磨。将混合物放入试管中，盖上瓶塞后在150℃加热10 min。待试管自然冷却后，依次加入20 μg内标和20 mL CH2Cl2，超声萃取15 min。用无水 Na2SO4去除水分，将提取液过滤，并减压浓缩至1 mL进GCMS分析。每个样品至少制备和测试2个重复。

1.2.2 气相色谱-质谱分析

色谱条件:进样量为1 μL，分流比5∶1。色谱柱为 HP-5MS(60 m × 0.25 mm，0.25 μm)，载气为高纯He，流量1.0 mL/min，进样口温度240℃。升温程序为:初始温度50℃，保持5 min，以8℃/min升至250℃，保持10 min。质谱电离能为70 eV，离子源温度230℃，扫描范围35～350amu。

1.2.3 反应产物的定性和定量

先将得到的质谱与NIST 08质谱库和标准物质(authentic compounds，AC)(对于有标样的物质)的质谱进行比较，对挥发性成分进行初步鉴定，再使用正构烷烃的保留时间计算出各成分的线性保留指数(linear retention indices，LRI)［9］并与文献值和标准物质(对于有标样的物质)的结果进行比对，保留LRI偏差小于15的物质。忽略响应因子(假定都是1)和回收率(假定100%)的影响，令内标和目标物质的峰面积比等于其浓度比，对鉴定的成分进行近似定量。

1.2.4 数据统计

实验结果用平均值±标准偏差的形式表示，不同处理的差异显著性采用单因素方差分析测定，多重比较采用 Duncan法，显著性水平为0.05，使用 SPSS 19.0软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 形成的挥发性成分分析

1水D-葡萄糖、D-葡萄糖及D-果糖与脯氨酸的固相美拉德反应产物鉴定结果如表1所示，共鉴定了9个挥发性成分。2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮(DDMP)是这些挥发性成分中含量最高的物质。DDMP是脯氨酸美拉德反应模型中产量最大的挥发性成分之一，也是美拉德反应尤其是2，3-烯醇化路径的标志［10］。此外，DDMP可能是一种重要的香味物质-麦芽酚的前体物。4-羟基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)、2，4-二羟基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(DDF)和5-羟基麦芽酚是脯氨酸美拉德反应模型产物中重要的香味物质，具有焦糖和烘焙特征香气［7，11］;2-糠醇、2-乙酰呋喃、5-甲基-2-糠醇和2-环戊烯-1，4-二酮分别具有燃烧味、焦糖香、奶甜味和焦辛甜香特征气味［12］。1-羟基-2-丙酮是糖降解的产物，可以做为糖降解反应或者焦糖化反应发生的标志物［13］。葡萄糖和果糖与脯氨酸的美拉德反应产物具有强烈的甜的焦糖香味，以上几种具有甜香、焦糖及焙烤特征气味的物质可能对其总体香味有重要贡献。本文重点关注几种有焦糖香味的物质:2-乙酰呋喃、DDF、HDMF和5-羟基麦芽酚，研究反应温度、反应物比例以及葡萄糖分子中结晶水等因素对其生成量的影响，并推测其形成机理。

表1 葡萄糖及果糖与脯氨酸在150℃加热10 min生成的挥发性成分以及它们的气味Table1 Formation of the volatile compounds in the reaction of glucose and fructose with proline heated at 150℃for 10 min and their odour

2.2 温度对几种重要焦糖风味物质生成量的影响

相对于液相美拉德反应，固相美拉德反应通常在较高的温度下进行［5，13-14］。因此，将葡萄糖或果糖与脯氨酸的等摩尔混合物分别在150、200、250、300℃和350℃下反应10 min，考察反应温度对几种选定产物生成量的影响。

图1显示了不同温度下4种物质的生成量。2-乙酰呋喃受温度影响小于其他3种物质。相对于1水葡萄糖和葡萄糖，果糖与脯氨酸的反应更有利于2-乙酰呋喃的生成。葡萄糖分子中含有结晶水对2-乙酰呋喃的生成没有明显影响。对于DDF来说，温度对其生成量有显著的影响。果糖-脯氨酸、1水葡萄糖-脯氨酸及葡萄糖-脯氨酸反应体系中DDF最有利的生成温度分别为250、200和150℃。温度对HDMF和5-羟基麦芽酚的影响相似，二者的最大生成量都在300℃左右，这可能预示着二者有相同的前体物或者反应路径。葡萄糖-脯氨酸混合物生成的HDMF和5-羟基麦芽酚含量要明显高于果糖-脯氨酸和1水合葡萄糖-脯氨酸体系。说明葡萄糖相较于果糖更有利于产生HDMF和5-羟基麦芽酚，葡萄糖分子中存在结晶水会对二者的产生造成不利影响。

图1 温度对几种焦糖风味物质生成量的影响Fig.1 Formation amounts of caramel-like aroma compounds in the reaction of reducing sugars with proline at different temperatures

2.3 反应物摩尔比对几种重要焦糖风味物质生成量的影响

在固相美拉德反应模型中，还原糖和氨基酸的比例通常是 1∶1［5，15］(摩尔比或质量比)，但不同实际样品中的反应物比例会有很大差异。本文研究了还原糖脯氨酸比例对几种焦糖香物质生成量的影响，如图2所示。

图2 还原糖脯氨酸摩尔比对几种焦糖风味物质生成量的影响(同组不同字母代表有显著差异(P＜0.05))Figure 2 Formation amounts of caramel-like aroma compounds with different molar ratios of reducing sugar to proline

总体上看，还原糖氨基酸比例对2-乙酰呋喃的影响较小，对DDF、HDMF和5-羟基麦芽酚的生成量影响较大。如图2A所示，果糖脯氨酸相较于葡萄糖脯氨酸更容易受到反应物比例的影响，且还原糖脯氨酸摩尔比小于1∶1时更有利于2-乙酰呋喃的生成。还原糖脯氨酸比例对DDF、HDMF和5-羟基麦芽酚的影响规律相似，如图2B、图2C及图2D所示，当还原糖脯氨酸摩尔比小于1∶1时，3种物质的生成量较低，当还原糖脯氨酸摩尔比大于1∶1时，3种物质的生成量较高，特别是5-羟基麦芽酚，而当还原糖脯氨酸摩尔比为2∶1时，3种物质的生成量最大。葡萄糖中含有结晶水对2-乙酰呋喃、HDMF及5-羟基麦芽酚的生成产生了显著的影响。水分对美拉德反应的影响比较复杂，其机理还不十分清楚。原因可能是结晶水在反应中挥发会消耗能量，进而影响到了某些反应路径，结晶水的存在也可能会改变反应物及一些反应中间体的存在状态，进而造成反应产物的显著差异。

2.4 还原糖脯氨酸美拉德反应路径及几种焦糖香物质的形成机理

温度和反应物比例对DDF、HDMF和5-羟基麦芽酚的影响规律比较相似(图1和图2)，这说明三者可能有共同的前体物。葡萄糖和果糖与脯氨酸经过一系列的美拉德前期反应生成了活性中间体-去氧二羰基化合物［16］，例如 1-去氧-2，3-己二酮糖。它可以通过环化及一系列异构化后脱水形成DDMP，DDMP可以氧化生成5-羟基麦芽酚［17］。作者发现DDMP和5-羟基麦芽酚的生成量之间有很强的相关性(数据没有给出)，这也证明了二者间的前体物-产物关系。1-去氧-2，3-己二酮糖通过异构化和脱水可以形成一种二去氧二酮糖化合物，此化合物可以转化成DDF，DDF经过还原和脱水形成HDMF［18］。此外，一些糖裂解产物也可以反应生成HDMF，例如1-羟基-2-丙酮和2-氧代丙醛。这些产物在美拉德反应中很容易得到［8］。2-乙酰呋喃主要有2种形成路径，一种是Amadori化合物通过Strecker降解生成，得到的2-乙酰呋喃侧链甲基上的碳来自于氨基酸;另一条路径中1-去氧-2，3-己二酮糖脱水形成一种二去氧己二酮糖，此化合物环化后脱2个分子水生成2-乙酰呋喃，此路径中2-乙酰呋喃的6个碳原子全部来自于还原糖。在液相美拉德反应中，2条路径都有发生，且第二条路径占主要地位;而在裂解条件(固相反应)下，2-乙酰呋喃只通过第二条路径生成［6］。

2-乙酰呋喃受温度和反应物比例影响都比较小，这可能暗示其反应路径和中间体比较稳定，不易受反应条件影响。而DDF受温度的影响与还原糖种类有关。HDMF和5-羟基麦芽酚生成量随着温度的升高而增加，且在300℃时达到最大值。在温度较高时，去氧二羰基化合物中间体等物质的活性较高，也更容易转化和降解生成HDMF和5-羟基麦芽酚，但当温度更高时，副反应增多，其生成量下降。

还原糖在美拉德反应中的消耗速度高于脯氨酸，其中一个重要原因是从还原糖和脯氨酸混合物到生成去氧二羰基化合物的反应过程中，脯氨酸实际上起催化剂的作用，其消耗速度慢于还原糖［19］。这可能是还原糖氨基酸比例影响美拉德反应产物种类和生成量的主要原因。果糖在美拉德反应中通常比葡萄糖表现出较高的反应活性［3］，但是，研究发现葡萄糖与脯氨酸反应生成的DDF、HDMF和5-羟甲基麦芽酚远多于果糖脯氨酸混合物，在还原糖过量时这个现象更加明显(图2)，也就是说葡萄糖比果糖具有更高的活性。原因主要在于脯氨酸具有特殊的结构，使其具有催化醛醇缩合反应的活性，因此在美拉德反应中它可以提高葡萄糖的活性［15］。

3 结论

温度和反应物比例对2-乙酰呋喃的生成影响较小，而对DDF、HDMF和5-羟基麦芽酚的生成有很大影响，且影响规律类似。4种焦甜香味物质都可以由同一个前体物1-去氧-2，3-己二酮糖生成，解释了温度和反应物比例对DDF、HDMF和5-羟基麦芽酚的生成影响规律类似的原因。由于脯氨酸的特殊催化活性，葡萄糖比果糖表现出更高的反应活性，且葡萄糖中含有结晶水会对会上述几种物质的生成造成不利影响。本文的研究的美拉德反应模型在固相中进行，可以为烘焙、烧烤及卷烟燃烧时焦糖香物质的生成提供参考。

［1］ van Boekel M A J S.Formation of flavour compounds in the Maillard reaction ［J］. Biotechnology Advances，2006，24(2):230-233.

［2］ Friedman M.Food browning and its prevention:an overview ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44(3):631-653.

［3］ Hwang I G，Kim H Y，Woo K S，et al.Biological activities of Maillard reaction products(MRPs)in a sugar-amino acid model system ［J］.Food Chemistry，2011，126(1):221-227.

［4］ Maillard M-N，Billaud C，Chow Y-N，et al.Free radical scavenging，inhibition of polyphenoloxidase activity and copper chelating properties of model Maillard systems［J］.LWT-Food Science and Technology，2007，40(8):1 434-1 444.

［5］ Nishibori S，Bernhard R A.Model system for cookies:Volatile components formed from the reaction of sugar and beta-alanine［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1993，41(12):2 374-2 377.

［6］ Wnorowski A，Yaylayan V A.Influence of pyrolytic and aqueous-phase reactions on the mechanism of formation of Maillard products［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(8):3 549-3 554.

［7］ Blank I，Devaud S，Matthey-Doret W，et al.Formation of odour-active compounds in Maillard model systems based on proline［C］.Beaune:Flavour Research at the Dawn of the Twenty-first Century，Proceedings of the 10th Weurman Flavour Research Symposium，2002-6-24.

［8］ Blank I，Devaud S，Matthey-Doret W，et al.Formation of odorants in Maillard model systems based on L-proline as affected by pH ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(12):3 643-3 650.

［9］ van Den Dool H，Dec Kratz P A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography［J］.Journal of Chromatography A ，1963，11(0):463-471.

［10］ Yaylayan V A.，Mandeville S.Mechanistic pathway for the formation of maltoxazine from intact 1-［(2 ＇-carboxyl)pyrrolidinyl］-1-deoxy-D-fructose(Amadori-Proline)［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42(9):1 841-1 844.

［11］ Cutzach I，Chatonnet P，Henry R，et al.Identifying new volatile compounds in toasted oak［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(4):1 663-1 667.

［12］ 毛多斌，鞠华波，牟定荣等.1-L-亮氨酸-1-脱氧-D-果糖和1-L-异亮氨酸-1-脱氧-D-果糖的热裂解［J］.中国烟草学报，2010，6(12):1-9.

［13］ Ait A L，Rega B，Giampaoli P，et al.The fate of furfurals and other volatile markers during the baking process of a model cookie［J］.Food Chemistry，2008，111(3):758-763.

［14］ Nishibori S，Kawakishi S.Effects of dough materials on flavor formation in baked cookies［J］.Journal of Food Science，1990，55(2):409-412.

［15］ Britt P F，Buchanan A C，Owens J C V，et al.Does glucose enhance the formation of nitrogen containing polycyclic aromatic compounds and polycyclic aromatic hydrocarbons in the pyrolysis of proline?［J］.Fuel，2004，83(8):1 417-1 432.

［16］ Ledl F，Schleicher E.New aspects of the Maillard reaction in foods and in the human body［J］.Angewandte Chemie International Edition in English，1990，29(6):565-594.

［17］ Yaylayan V A，Mandeville S.Stereochemical control of maltol formation in Maillard reaction ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42(3):771-775.

［18］ Cutzach I，Chatonnet P，Dubourdieu D.Study of the formation mechanisms of some volatile compounds during the aging of sweet fortified wines［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47(7):2 837-2 846.

［19］ Van Boekel Martinus A J S，Martins S I F S.Fate of glycine in the glucose-glycine reaction:a kinetic analysis［J］.International Congress Series，2002，1 245(11):289-293.