赵力超，宁德山，李双祁，杜 洁，王 燕，曹 庸，*

(1.华南农业大学食品学院，广东广州510642;2.无限极(中国)有限公司，广东广州510623;3.广州绿萃生物科技有限公司，广东广州510663)

高血压是当今世界最常见的心血管疾病之一，生活方式和饮食改善是有效降低血压的重要途径［1］。随着人民生活水平的不断提高和保健意识的不断增强，利用功能食品来调节生理状况的观点，已越来越为消费者所接受。基于消费者对天然来源功能因子的追求，以食品为原料开发降压功能产品将是未来预防、缓解和治疗高血压的一种有效手段。血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE，EC 3.4.15.1)是一种重要的血压控制酶，对其抑制可有效的降低血压。一些活性肽表现出对ACE较强的抑制效果，统称为血管紧张素 I转化酶抑制肽(Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides，ACEI肽)，食源性ACEI肽是降压型功能食品中备受关注的一类产品。

其中，从食物蛋白中获得ACEI肽，虽然比人工合成的降压药物效果弱，但具有以下优势［2-3］:只对高血压患者起作用，对血压正常者无影响，因而不会产生降血压过度的问题;经食品级蛋白酶在温和条件下获得的，安全性极高，无副作用;活性多样性，除降血压功能外，往往还具有免疫促进、抗凝血、易消化吸收、抗肿瘤等功能;具有较好的酸、热稳定性、水溶性和勃度随浓度变化迟缓等加工优点，易于作为功能因子添加到各类食品中。1979年，Oshima首次从食物蛋白质分离到食源性ACEI肽［4］后，多种不同食物来源的ACEI肽相继被发现，所涵盖到的食物蛋白源包括:各种植物蛋白［5-6］，如大豆、菜籽;乳源蛋白［7-8］，如酪蛋白和乳清蛋白;各种肉蛋白［9-10］，如猪肉、鱼和鸡蛋蛋白;还有大型真菌类［11］，如藻类和蘑菇等。国外已有多种商业化的乳源ACE抑制肽制品面市［12-13］，而我国 ACEI肽的商品化尚处于起步阶段，国内已有从牛奶、酸奶、玉米、大豆、米糟、鸡蛋、鱼贝、海藻和肉类等食物蛋白质的酶解产物或发酵制品中发现ACEI肽的报道［13］，但市场上仍鲜有相应的降血压产品。究其原因，高活性的ACEI肽产品要求对蛋白质酶解产物进行反复的分离提取，目前的产业化分离纯化工艺成本较高。此外，较贵的蛋白来源也限制了多肽的利用。所以如何利用蛋白产品的副产物，通过简单工艺分离富集ACEI肽是今后发展的重点。

酪蛋白磷酸肽(Casein phosphopeptides，CPPs)是酪蛋白生物活性肽中被研究和开发最早的一种，具有结合矿物质的作用。也是酪蛋白生物活性肽中研究最多的一种。CPPs生产企业生产过程中，有近80%的蛋白质副产物(Casein phosphopeptides byproduct，CPPBP)未被合理利用，作为饲料或废物弃去，造成资源浪费和环境污染。因此，最大程度地开发CPPBP中的活性肽具有很大的经济效益和社会效益。本文即以CPPBP为原料，定位ACEI肽，研究其量化富集工艺，为其商品化提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

CPPBP 工厂生产CPPs后的杂多肽饱和水溶液，广州绿萃生物科技有限公司;血管紧张素转化酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE) 活力单位0.1U/mL，美国 sigma公司;马尿酰组氨酰亮氨酸(Ⅳ-hippuryl-His-Leu tetrahydrate，HHL) 分析纯，美国sigma公司;胃蛋白酶 活力单位3000U/mg，分析纯，广州市齐云生物技术有限公司;胰蛋白酶 活力单位250U/mg，分析纯，广州市齐云生物技术有限公司;乙腈 色谱纯，德国 Fisher公司;三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)、马尿酸(Hippuric acid)色谱纯，美国sigma公司。其他试剂均为分析纯。

Diamonsil C18色谱柱 200mm ×4.6mm，5μm，中国迪马科技有限公司;LC-10A高效液相色谱仪 日本岛津公司;TUS-200恒温金属浴 中国上海一恒科技有限公司;DL-5-B低速离心机 中国上海安亭科学仪器厂。

1.2 设计及方法

1.2.1 研究思路 以CPPBP为原料，首先利用多肽在不同pH和有机溶剂条件下溶解度不同的原理对其进行粗分离。通过检测各粗分离组分的ACE抑制活性，确定ACEI肽存在部位;其次，通过高效液相法(HPLC法)，精确定位组分中活性单体的位置;最后以活性单体为分离目标设计正交方案，研究产业化可行的富集工艺。

1.2.2 ACE抑制活性测定 参考Cushman［14］的方法并加以改进，ACE浓度为0.25U/mL，流动相与色谱条件根据实验条件更改为:乙腈∶超纯水=25∶75(含0.1%(v/v)TFA)。ACE抑制率结果计算如式(1):

式中:R:ACEI样品对ACE的抑制率(%)，A:对照管中马尿酸的峰面积，B:样品管中马尿酸的峰面积，A0:空白管中马尿酸的峰面积。

1.2.3 粗分离条件研究 分别选择pH、乙醇浓度、温度这三个因素对CPPBP进行粗分离。其中pH选择2、4、6、8、10、12，6 个水平;乙醇浓度选择 10%、30%、50%、70%、90%，5 个水平;温度选择-16、0、4℃，3个水平。pH、乙醇浓度、温度分别固定在6、50%、0℃。每个水平处理1h后，4000r/min下离心30min，记录沉淀质量、上清液体积及上清液水分含量(取上清液冻干，测含水量)，沉淀60℃下烘干后备用。在单独处理的基础上，选择具有明显分离效果的条件进行交互处理。按式(2)定量计算不同因素水平下多肽沉淀得率。

式中:C:沉淀得率(%)，M:沉淀质量(g)，V:上清液体积(mL)，W:上清液水分含量(%)。

利用高效液相色谱分析检测CPPBP原料及不同因素水平沉淀物中多肽的组成。检测条件为:色谱柱:Diamonsil C18(200mm ×4.6mm，5μm);流动相:A泵超纯水(含0.1%(v/v)TFA)，B泵乙腈(含0.1%(v/v)TFA)，B泵初始浓度为10%;洗脱方式:二元梯度洗脱;0.01～40min，10% ～70%;40.01～45min，90%;流速:1mL/min;检测波长 214nm;进样量20μL。

对不同因素水平下的沉淀物进行ACE抑制活性检测，确定活性多肽粗富集条件。

1.2.4 活性单体的确定 采用分析型高效液相色谱(HPLC)对1.2.2中活性高的粗富集组分进行制备，得到单体。并对分离到的单峰物质进行ACEI活性检测，确定最高活性单体的出峰时间，为扩大化富集活性组分提供目标。制备条件为:色谱柱:Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm);流动相:A 泵超纯水(含0.1%(v/v)TFA)，B 泵乙腈(含0.1%(v/v)TFA)，B泵初始浓度为10%;洗脱方式:二元梯度洗脱;0.01～5min，5%～20%;5～50min，20% ～45%;50.01～55min，90%～90%;流速:1mL/min;检测波长214nm;进样量20μL。

1.2.5 ACEI肽量富集工艺的研究 取粗富集组分配成饱和溶液，针对活性单体的性质和出峰时间，以pH、乙醇浓度、温度为因素，以沉淀得率、ACE抑制肽含量为响应值，在单因素预实验的基础上，设计3因素3水平的正交实验，通过SPSS软件分析，确定最佳的ACEI肽扩大化富集工艺条件。其中三因素的水平表如表1所示。

表1 L9(34)正交实验的因素和水平Table 1 L9(34)Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 数据处理 以上所有实验数据平行测定3次，结果用平均值±标准偏差表示，采用Statistica6.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 CPPBP的ACE抑制活性

不同浓度CPPBP的ACE抑制率结果如表2所示。

表2 不同浓度的CPPBP ACE活性抑制率Table 2 ACE-inhibitory activities of different concentrations CPPBP

由表2可知，CPPBP具有ACE抑制活性，且有量效关系，说明CPPBP中含有ACE活性抑制成分。

2.2 ACEI肽粗富集条件研究

采用HPLC法对CPPBP进行多肽组成的测定，结果如图1所示。

图1 CPPBP的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of CPPBP

由图1可知，CPPBP的多肽组成较为复杂，很难直接确定ACEI肽的部位。欲以此为原料工业化制备出具有ACE抑制活性的多肽，首先需对其进行粗分离，并要定位活性组分的。

不同水平下pH、乙醇浓度、温度对CPPBP粗分离结果如表3所示。

由表3可知，当体系pH在2左右时，多肽沉淀得率最高，占41.52%，但随着pH升高，沉淀量显著降低;当乙醇浓度为90%时，多肽沉淀得率最高，为32.69%，其他条件下得率均很低;温度方面，低温对多肽的沉淀有贡献，-16℃时的沉淀率比4℃时提高64.3%。pH为2的沉淀组分和不同乙醇浓度下的沉淀组分的HPLC谱图见图2、图3。

表3 不同处理条件下沉淀得率Table 3 Precipitation rate under different treatment conditions

图2 pH2时沉淀组分的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of precipitation under pH2

图3 不同乙醇浓度下的沉淀组分的HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatograms of precipitations under different ethanol concentrations

由图1与图2的对比可知，当pH为2时，体系中沉淀集中在出峰时间为20～25min，即极性较小的组分被分离开，沉淀记PpH2。而图1与图3对比可知，当体系中有50%以上乙醇时，沉淀集中出峰时间为10～20min，即极性中等组分得到分离，沉淀记P乙醇。检测两部分沉淀物及上清液的ACE活性抑制率结果如表4所示。

由表4可知，CPPBP中对ACE有抑制活性的组分主要为pH为2时的沉淀组分，考虑到低温对多肽有进一步富集效果，实验在pH2和-16℃条件下处理CPPBP溶液，沉淀得率为58.10%，低温提高沉淀得率将近 28.5%。分离得到的沉淀命名为 P粗，其HPLC图谱如图4所示。

表5 100μg/mL P粗中单体的ACE活性抑制率Table 5 ACE-inhibitory activities of 100μg/mL monomers in Pcrude

表4 500μg/mL粗分离组分的ACE活性抑制率Table 4 ACE-inhibitory activities of 500μg/mL preliminary separation components

图4 P粗组分的HPLC图谱Fig.4 HPLC spectrogram of Pcrude

由图4可知，P粗中的多肽还是集中于20～25min之间，低温对峰型影响不大。

2.3 ACE抑制肽单体的确定

按1.2.4的方法分离P粗中各多肽单体，并按出峰时间顺序进行编号为P1、P2……，如图5所示。考虑到P粗中部分多肽含量极微，制备难度较大，后续工业化生产成本过高，因此选取含量相对比较大的多肽进行单体制备。各单体ACE活性抑制率如表5所示。由表5可知，单体P18的ACE活性抑制率最高，100μg/mL浓度下抑制率达到70%，在其附近的P16次之，但只有20.83%。P16与P18在HPLC图谱中出峰位置相近，因此量化富集工艺考虑以P16和P18为主要集中目标。

图5 P粗中单体制备的HPLC图谱Fig.5 HPLC spectrogram of monomers in Pcrude

2.4 扩大化富集工艺研究

在前期单因素研究的基础上，设计三因素三水平的正交实验，以沉淀得率、P16和P18在沉淀中含量这3个指标进行综合评分分析。正交实验结果如表6所示，SPSS分析结果如表7～表8所示。

表6 正交实验结果Table 6 Results of orthogonal experiment

利用SPSS软件对正交实验结果进行分析，由表7中F值的大小可以看出，pH、乙醇浓度和温度等3个因素对P粗中活性肽的分离均有极显著影响。影响沉淀率的顺序为:pH＞乙醇浓度＞温度;影响ACE抑制肽P16含量的顺序为:乙醇浓度＞温度＞pH;影响ACE抑制肽P18含量的顺序为:乙醇浓度＞pH＞温度。

表8 估算边际均值Table 8 Estimate of marginal mean

由SPSS估算边际均值分析表7中各因变量的均值可知，P粗中ACE抑制肽的沉淀率最大的方案为A1B3C3，P16和P18含量最大的方案均为A1B1C3，由于最优方案的差别只在于乙醇浓度，从经济和活性两方面出发，选择乙醇浓度为70%较佳，因此，均衡考虑各因素水平确定方案为A1B1C3，即pH4、乙醇浓度70%、-20℃。经过三次的验证实验，通过该制备工艺可从 P粗沉淀出 33.12%的多肽，其中含有28.07%的ACE抑制肽P16和7.88%的ACE抑制肽P18。综合第一步工艺得率，ACEI肽二段量化制备工艺最后ACEI肽产物得率为19.11%。经活性测定，最终产品的ACE抑制率为46.29%(500μg/mL)。

表7 主体间效应的检验Table 7 Tests of inter-subject effects

3 结论

研究CPPBP的分离特性，分析其中各性质组分多肽的组成。结果发现，具有明显粗分离效果的因素为pH2(溶液中极性较小组分沉淀而得到分离)、50%以上乙醇浓度(溶液中极性中等组分沉淀而得到分离)，而温度降低具有使各沉淀组分富集效果，-16℃最佳。而CPPBP中对ACE有抑制活性的组分主要集中在等电点为2和-16℃保存后沉淀部分。同时对粗富集物中各单体进行ACE抑制活性测定，得到单体P18的ACE抑制活性最高，其次为单体P16，并通过HPLC法定位两个单体的位置。

设计ACEI肽二段量化富集工艺。第一段即以CPPBP饱和多肽液为原料，设定沉淀条件为pH2、-16℃、沉淀1h，得到粗富集物(P粗)。第二段经过三因素三水平的正交实验，确定制备工艺为pH4、乙醇浓度70%、-20℃条件下，沉淀1h。最后二段量化富集工艺的ACEI肽产物得率为19.11%。经活性测定，500μg/mL产品的ACE抑制率为46.29%。

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