刘梅 周春林 朱红 金光玉 陈洪铎 何春涤

三种黄芩提取物诱导人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞凋亡的研究

刘梅 周春林 朱红 金光玉 陈洪铎 何春涤

目的探讨黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素3种黄芩提取物对人皮肤鳞状细胞癌细胞株SCL-1细胞凋亡的影响。方法将培养的SCL-1细胞分别用浓度为12.5、25、50、75、100 μmol/L的3种黄芩提取物作用12、24、48 h后，噻唑蓝(MTT)法检测上述药物对SCL-1细胞的生长抑制作用。膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭双染法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测SCL-1细胞凋亡率。流式细胞仪检测细胞周期。应用线性内差法，测定半数抑制浓度(IC50)；两样本均数比较用Studentt检验；多样本均数比较采用方差分析，各样本之间多重比较采用SNK-q检验。结果3种黄芩提取物均可抑制SCL-1细胞的生长，并具有浓度及时间依赖性(均P＜0.01)；在相同的药物浓度及作用时间下，黄芩素对SCL-1细胞生长抑制作用最强，黄芩苷抑制作用最弱，汉黄芩素抑制作用介于二者之间，差异具有统计学意义(均P＜0.01)。12.5 μmol/L黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素分别作用SCL-1细胞48 h均可诱导SCL-1细胞凋亡并阻滞细胞周期的进程，其中G1期细胞比例分别为56.37% ±2.41%、74.23% ±2.02%、64.15% ±1.87%， 早期凋亡率分别为8.09% ±1.02%、24.13% ±0.76%、14.45% ±1.57%，与对照组(45.04% ±1.93%，4.12% ±0.29%)比较，差异均有统计学意义(F=83.29，186.37，均P＜0.01)；其中黄芩素作用最强，其次为汉黄芩素，黄芩苷作用最弱。结论黄芩能抑制SCL-1细胞生长并诱导其凋亡，为皮肤鳞状细胞癌的中药治疗开拓新的思路。

黄芩；黄芩苷；黄芩素；汉黄芩素；癌，鳞状细胞；细胞凋亡

皮肤鳞状细胞癌(简称鳞癌)是最常见的皮肤恶性肿瘤之一，其发病率约占全部非黑素性皮肤恶性肿瘤的20%[1]，严重影响人类健康[2]。黄芩是应用较广的一种中草药，具有广泛的生物学活性。目前国内外研究表明，黄芩具有抗肿瘤作用，可以诱导多种肿瘤细胞凋亡[3-10]。本实验旨在探讨黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素3种黄芩提取物在体外诱导人皮肤鳞癌SCL-1细胞凋亡的作用并探讨其机制。

材料与方法

一、主要材料和试剂

1.细胞:人皮肤鳞癌细胞株SCL-1由德国柏林自由大学本杰明·富兰克林医学中心惠赠。

2.主要试剂:3种黄芩提取物(黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素)产自日本Wako公司；细胞培养液、胎牛血清产自美国Hyclone公司；噻唑蓝(MTT)、碘化丙锭(PI)、二甲基亚砜(DMSO)、丫啶橙均为美国Sigma公司产品；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染检测试剂盒产自美国BD公司；细胞死亡检测酶联免疫吸附实验(Cell Death Detection ELISA)试剂盒产自德国Roche公司。

二、方法

1.细胞培养:将SCL-1细胞接种于含有10%胎牛 血 清 、100 U/ml 青 霉 素 、100 μg/ml 链 霉 素 的RPMI1640培养液中，置于37℃、5%CO2孵箱中传代培养。

2.噻唑蓝(MTT)检测黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对SCL-1细胞的增殖抑制作用:将SCL-1细胞接种在96孔板上(每孔接种103个细胞)，于对数生长期向细胞培养液中分别加入浓度为 12.5、25、50、75、100 μmol/L的黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素(均用终浓度为0.1%的DMSO配制)，体积为180 μl/孔，每个浓度设6个复孔，各设6个对照复孔，对照组加终浓度为0.1%的DMSO。每隔24小时更换含同样药物浓度的新鲜培养液，分别培养12、24、48 h后，每孔加入 MTT 20 μl，37 ℃孵育 4 h， 弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，用酶标仪在490 nm处测吸光度A值，同时计算细胞存活率。细胞存活率=(加药组A值/对照组A值)×100%，实验结果重复3次。

3.Annexin-V/PI双染检测早期凋亡:用12.5μmol/L黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素分别作用于SCL-1细胞48 h，收集细胞，Annexin-V和PI染色，流式细胞仪检测细胞早期凋亡率。实验步骤按试剂盒说明书操作，实验结果重复3次。

4.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞凋亡:将SCL-1细胞接种于96孔板，于对数生长期向细胞培养液中加入浓度为12.5 μmol/L的黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素，体积为180 μl/孔，各设3个复孔，对照组加终浓度为0.1%的DMSO，间隔24 h更换含同样药物浓度的新鲜培养液，培养48 h后按试剂盒说明书检测细胞凋亡。

5.流式细胞仪检测细胞周期:用12.5 μmol/L的黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素分别作用于SCL-1细胞48 h后，收集细胞，冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，用75%冰乙醇固定过夜，加入含核糖核酸酶的碘化丙锭，流式细胞仪检测细胞周期。实验结果重复3次。

三、统计学处理

结 果

一、黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素对SCL-1细胞增殖抑制作用的比较

MTT结果显示，3种黄芩提取物均可以抑制人皮肤鳞癌细胞株SCL-1细胞增殖，随着作用时间的延长及药物浓度的增加，细胞存活率显著下降，呈明显的浓度与时间依赖性(r值分别为-0.67，-0.42，均P＜0.01)。在相同的药物浓度及作用时间下，黄芩素对SCL-1细胞生长抑制作用最强，黄芩苷抑制作用最弱，汉黄芩素抑制作用介于二者之间；差异具有统计学意义(均P＜0.01)。黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素在48 h对SCL-1细胞的IC50分别为88.23、18.78、48.37 μmol/L。 见图 1。

二、黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素对SCL-1细胞早期凋亡的影响

12.5 μmol/L黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素分别作用于SCL-1细胞48 h后，均能诱导SCL-1细胞早期凋亡，早期凋亡率分别为8.09%±1.02%、24.13%±0.76%、14.45%±1.57%，而对照组早期凋亡率为4.12%±0.29%，组间差异均有统计学意义(F=186.37，P＜0.01)；其中黄芩素凋亡诱导作用最强，黄芩苷最弱，汉黄芩素介于二者之间，见图2。

三、黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素对SCL-1细胞的凋亡诱导作用

12.5 μmol/L黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素均能诱导SCL-1细胞凋亡，A值分别为0.415±0.047，0.705±0.078，0.574±0.064，与对照组(0.239± 0.048)比较，差异有统计学意义(均P＜0.05)，黄芩素对SCL-1细胞的凋亡诱导作用强于汉黄芩素及黄芩苷，差异有统计学意义(均P＜0.05)。

图1 3种黄芩提取物对SCL-1细胞的增殖抑制作用

图2 3种黄芩提取物对SCL-1细胞凋亡的诱导作用 2a:溶媒对照；2b:黄芩苷；2c:汉黄芩素；2d:黄芩素

图3 3种黄芩提取物对SCL-1细胞周期的阻滞 3a:对照；3b:黄芩苷；3c:汉黄芩素；3d:黄芩素

四、黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素对SCL-1细胞细胞周期的影响

12.5 μmol/L黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素作用SCL-1细胞48 h后，与对照组比较，均能够阻滞细胞周期的进程，将细胞阻滞于G1期(图3)。其中黄芩素作用最强，G1期细胞比例为74.23%±2.02%，其次为汉黄芩素(64.15%±1.87%)，黄芩苷作用最弱(56.37%±2.41%)，各组间差异有统计学意义(F=83.29，P＜ 0.01)。

讨 论

黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根，性寒、味苦，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效，在临床中属于常用中药。黄芩中生物活性成分是黄酮类化合物，主要有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素。黄芩在抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡方面的研究是近几年来国内外医药研究的热点之一。最为重要的是，黄芩对正常上皮细胞、正常外周血细胞及骨髓细胞没有或仅有轻微的毒性作用[3]。目前研究发现，黄芩可能是通过以下几种机制来抑制肿瘤细胞增殖的:①抑制花生四烯酸代谢的脂氧合酶(LOX)途径:12-LOX可将花生四烯酸代谢为12-羟基廿碳四烯酸(12-HETE)，后者对恶性肿瘤细胞产生多种生物学效应；黄芩素作为12-LOX的选择性抑制剂，可以诱导和加速前列腺癌细胞凋亡[5]；②降低与细胞周期相关的酶及蛋白的表达，影响细胞周期分布:黄芩素可使人骨肉瘤细胞阻滞于G1期[6]；③诱导线粒体凋亡途径:如黄芩苷诱导人结直肠癌细胞凋亡是通过线粒体凋亡途径[7]；④下调肿瘤细胞端粒酶活性:如汉黄芩素通过抑制端粒酶活性而诱导人白血病细胞凋亡[8]；⑤作用于与凋亡相关的基因与蛋白进而诱导肿瘤细胞凋亡:如黄芩诱导人肺癌细胞凋亡，上调p53和bax的表达[9]；⑥通过抑制环氧化酶(COX)-2进而抑制前列腺素E2(PGE2)的合成并诱导肿瘤细胞凋亡:如黄芩诱导人头颈部鳞状细胞癌细胞凋亡[10]。

本研究以培养的人皮肤鳞癌SCL-1细胞株为研究对象，比较3种黄芩提取物(黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素)对其生长的影响。研究结果显示，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素均能不同程度地抑制人皮肤鳞癌细胞增殖，呈明显的浓度与时间依赖性；其中黄芩素对人皮肤鳞癌细胞生长抑制作用最强，黄芩苷作用最弱，汉黄芩素介于二者之间。Annxin V/PI结合实验和ELISA结果显示，3种黄芩提取物均能诱导SCL-1细胞凋亡，其中黄芩素凋亡诱导作用最为显著，黄芩苷最弱，汉黄芩素介于二者之间；提示中药黄芩对人皮肤鳞癌SCL-1细胞的增殖抑制可能与凋亡的诱导作用有关。

肿瘤的发生是一个多步骤的复杂过程，由细胞周期调控紊乱所致的细胞无限增殖，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关[11]。我们的研究结果显示，3种黄芩提取物均能阻滞人皮肤鳞癌SCL-1细胞周期进程，将细胞阻滞于G1期，其中黄芩素的作用最为显著，提示中药黄芩可以通过阻滞细胞周期的进程而抑制人皮肤鳞癌细胞生长并诱导其凋亡。

随着皮肤鳞癌发病率的持续上升，早期干预及防治已成为人们日益关注的一个问题。我们在前期研究工作中发现[12]，3种维A酸(全反式维A酸、阿维A及他扎罗汀)均能抑制人皮肤鳞癌细胞生长及诱导其凋亡。然而，由于维A酸类药物具有较强的致畸性，常会引起患者血脂升高及肝功能损害，使其临床应用受到一定限制。本研究从体外证实中药黄芩具有抑制人皮肤鳞癌细胞增殖并诱导其凋亡作用，从而为皮肤鳞癌的中药治疗开拓新的思路。

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2013-09-12)

(本文编辑:尚淑贤)

Three Scutellaria baicalensisextracts induce the apoptosis of a human cutaneous squamous cell carcinoma cell line SCL-1：an experimental study

Liu Mei，Zhou Chunlin，Zhu Hong，Jin Guangyu，Chen Hongduo，He Chundi.Key Laboratory of Immunodermatology of Ministry of Health；Department of Dermatology，First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China

He Chundi，Email：chundihe@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect of threeScutellaria baicalensisextracts(baicalin，baicalein and wogonin)on the apoptosis of a human cutaneous squamous cell carcinoma cell line，SCL-1.MethodsMethyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was performed to detect the proliferation of cultured SCL-1 cells treated with different concentrations(12.5，25，50，75 and 100 μmol/L)of baicalin，baicalein and wogonin for various durations(12，24 and 48 hours).Some SCL-1 cells were treated with baicalin，baicalein and wogonin of 12.5 μmol/L respectively for 48 hours followed by the detection of cell apoptosis by double staining with annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide in combination with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，as well as estimation of cell cycle by flow cytometry.The 50%inhibitory concentration was determined by line regression model and inner insert method，and statistical analysis was carried out by Student'sttest，one-way analysis of variance(ANOVA)，and Student-Newman-Keuls-q test.ResultsBaicalin，baicalein and wogonin all inhibited the proliferation of SCL-1 cells in a dose-and time-dependent manner(allP＜0.01).Under the same conditions(treatment concentration and duration)，baicalein showed the strongest inhibitory effect on the proliferation of SCL-1 cells，followed by wogonin and baicalin(allP＜ 0.01).All theScutellaria baicalensisextracts induced the apoptosis of SCL-1 cells and arrested them in G1-phase.The percentage of cells in G1 phase was 56.37% ±2.41%，74.23% ±2.02%and 64.15%±1.87%，and early apoptosis rate was 8.09%±1.02%，24.13% ±0.76%and 14.45% ±1.57%，in SCL-1 cells treated with baicalin，baicalein and wogonin of 12.5 μmol/L for 48 hours，respectively，compared to 45.04% ± 1.93%and 4.12% ± 0.29%in the untreated control cells respectively(F=83.29，186.37，respectively，bothP＜ 0.01).Similarly，there was a downward trend from baicalein to wogonin and baicalin in the effect on cell apoptosis and cell cycle arrest of SCL-1 cells.ConclusionsScutellaria baicalensiscan inhibit the growth and induce the apoptosis of SCL-1 cells，which may provide new ideas for the treatment of cutaneous squamous cell carcinoma with traditional Chinese drugs.

Scutellaria baicalensis；Baicalin；Baicalein；Wogonin；Carcinoma，squamous cell；Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.011

辽宁省科技厅科学技术计划项目(2012225016)；辽宁省教育厅创新团队项目计划(2008T193)；辽宁省高等学校优秀人才支持计划(LR201040)；辽宁特聘教授资助课题(辽教发[2012]145)

110001沈阳，中国医科大学附属第一医院皮肤科，卫生部免疫皮肤病学重点实验室

何春涤，Email:chundihe@hotmail.com