秦桂芳，魏 萌，韩愈杰，王荣杰，吴国江，郝庆红，郭云霞，侯淑梅

（1.河北大学中医学院，河北 保定 071001；2.河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071001；3.河北-兽药业有限公司，河北 石家庄 052460；4.河北省阜平县发展改革局，河北 阜平 073200）

大肠杆菌、沙门菌、痢疾杆菌为肠道常见致病菌，其中大肠埃希菌[1]发病率最高，其次为沙门菌和痢疾杆菌，临床表现为胃肠炎、伤寒和中毒性休克等[2-3]。抗生素治疗后，先有症状好转，继而恶化，常为本病的重要特征，为此人们趋向于选用传统的中草药[4-5]对该病进行防控。一方面可以很好控制疾病，同时也可避免抗生素对有益菌的杀灭作用[6-7]，以提高有益菌对肠道菌群平衡调节作用，抑制致病菌生长，减少肠道疾病发生[8-9]。

本研究选用二妙丸、太无神术散方剂中药物，观察单味药物及方剂对大肠杆菌、沙门菌和痢疾杆菌等致病菌及枯草芽孢杆菌J-4的抑制作用，为开发安全、无残留的微生态中药制剂，提高食品安全和生态安全提供理论和应用依据。

1 材料与方法

1.1 菌种 鸡源枯草芽孢杆菌J-4(Bacillus subtilis)、大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门菌（Salmonella）、痢疾杆菌（Shigella dysenteriae），均由河北农业大学制药工程实验室提供。

1.2 中草药 黄柏、黄连、苍术、藿香、穿心莲、石菖蒲、陈皮、厚朴、生姜、大枣，均购自河北省安国中药材市场。

1.3 培养基 NA：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.2-7.4。NB：NA培养基去掉琼脂即可。

1.4 中草药提取液的制备 取中药饮片或方剂药物50 g，3～8倍蒸馏水浸泡1 h后煎煮，沸后文火加热30 min，收集滤液，滤渣重煎2次，合并滤液并浓缩至50 mL（生药含量为1g/mL），115℃下灭菌30 min，置4℃冰箱内备用。

1.5 菌种活化 将菌种接种于NB培养基中，37℃摇床培养24 h，采用稀释涂布法测定菌液浓度，并配制成菌含量为108CFU/mL的目标菌液，备用。

1.6 单味中药抑菌效果的测定 培养皿中倒入NB培养基，待凝固后，取目标菌液0.1 mL均匀涂布于平板上，于表面等距离放置3个无菌牛津杯，分别加入中药液50 μL，以蒸馏水为对照，37℃恒温培养箱中培养24 h，测定抑菌圈直径，每种药液做3个平行。

1.7 二妙丸、太无神术散抑菌效果的测定 取2%目标菌液加入到温度为58℃左右NA培养基中，摇匀，分别制备病原菌及J-4平板，并在各平板中等距离打孔7个，每孔加生药液50 μL，以蒸馏水为对照，37℃培养18～24 h后，测量抑菌圈直径，每种药液做3个平行。

1.8 单味中药及方剂对J-4增殖影响 取制备药液加入NB培养基中，使其终浓度分别为2%、1%、0.5%、0.25%，按2%接种量接种J-4目标菌液，37℃下培养24 h后在600 nm下测定菌液的OD值，每个浓度3个平行，以未接J-4的相应中药NB培养基调零，以不加中药的J-4 NB培养基作为对照。

1.9 复配制剂抑菌效果的测定 在二妙丸和太无神术散原方比例基础上，增加黄连和穿心莲重新配伍，采用1.2.1方法制备，以蒸馏水为对照，观察其抑菌效果。

1.10 中草药MIC的测定 将中药提取液用NB培养基2倍系列稀释10个梯度，第11支试管作阳性对照，第12管作阴性对照，各管稀释后的最终体积为1 mL，每管加菌悬液1 mL，置37℃培养18 h～24 h，观察是否有菌生长，药物稀释管中清澈透明、无菌生长者为药物对该菌的最小抑菌浓度。

2 结果和分析

2.1 单味中药对致病菌和J-4的抑菌结果 见表1。

表1 单味中药对致病菌和J-4抑制作用

从表1看出，对大肠杆菌，黄连、黄柏为高敏，抑菌圈直径分别为17.00 mm、15.00 mm，穿心莲、石菖蒲为中敏；陈皮、生姜为低敏；对沙门氏菌，石菖蒲为高敏，抑菌圈直径为16.53 mm；黄柏、黄连为中敏外，其他均为低敏；对痢疾杆菌，均为低敏；而对J-4除黄连为中敏外，其他均为无效。

2.2 二妙丸、太无神术散对致病菌和J-4抑菌结果 见表2。从表2看出，太无神术散对三种致病菌强于二妙丸，对J-4为无效；二妙丸对J-4为低敏。

表2 二妙丸、太无神术散对致病菌及J-4抑菌结果

2.3 单味中药及方剂对J-4增殖作用 见表3。由表3可知，2%太无神术散对J-4增殖效果最明显；其他中药对J-4增殖效果依次为石菖蒲＞藿香＞厚朴＞穿心莲＞二妙丸＞黄柏＞大枣，而苍术、陈皮则对J-4增殖不明显，黄连和生姜则表现出抑制作用。

2.4 复配制剂抑菌效果测定结果 从表4看出，复配制剂对三种致病菌均表现为高敏，其中对大肠杆菌作用最强，可达到18.74 mm，对J-4表现为中敏。

表3 单味中药与方剂对J-4的增殖作用

表4 复配制剂对致病菌及J-4抑菌结果

2.5 中药MIC结果 见表5。由表5可知，复配制剂对3种致病菌的MIC最低，为3.9～7.8 mg/mL；对J-4，黄连的MIC最低，为125 mg/mL，而复配制剂对J-4 MIC为250 mg/mL。

表5 各中药的MIC

3 讨论

化学药物长期使用，势必增加细菌耐药性，严重破坏机体器官各项机能，药物残留也给食品安全带来隐患，因此人们逐渐将肠道疾病的防控转向中药和益生菌[10]。现代研究证实，二妙丸具有解热、抗炎、镇痛和促消化作用[11]，太无神术散临床可用于治疗胃肠炎、病毒感染[12]和消化机能障碍[13]等疾病，因此，对二妙丸、太无神术散进行合并应用，重新配伍成黄连2 g、穿心莲9 g、黄柏、苍术、陈皮各12 g，藿香、厚朴、石菖蒲各10 g，生姜4 g，大枣20 g，提高抗肠道疾病作用。

从试验结果看，苍术、藿香、大枣对大肠杆菌、沙门菌、痢疾杆菌和J-4均无拮抗作用，石菖蒲、藿香有拮抗致病菌和促进J-4增殖作用。太无神术散对3种致病菌抑制作用强于二妙丸，且对J-4生长无影响，太无神术散与二妙丸合并后，因增加黄连和穿心莲可使其拮抗致病菌效果，尤其是对大肠杆菌的拮抗效果明显高于单独方剂，抑菌圈可达18.74 mm，MIC在3.9～7.8 mg/mL，复配制剂对J-4益生菌的抑菌圈为10.50 mm，为中敏，MIC为250 mg/mL，说明复配抑菌剂对致病菌抗菌作用强，对肠道益生菌杀灭作用微弱，这与李平兰等[14]结果类似，表明复配制剂具有合生元的潜能，为进一步开发中药合生元奠定了基础。

[1]苏广珠，贺坤，裴凤艳.6种中草药抑菌活性的研究[J].中国临床研究，2012，25（8）:801-802.

[2]张霞，艾启俊，孙宝忠，等.中草药提取物对沙门氏菌的抑菌效果研究[J].食品工业科技，2010，31(1):88-90.

[3]闫兵.蟾酥对痢疾杆菌抑菌作用的影响[J].牡丹江师范学院学报，2010，73(4):30-31.

[4]余园媛.复方黄连凝胶剂体内抗菌活性研究[J].中国医药指南，2008，6(18):47-50.

[5]唐艳，张宾，霍健聪，等.12种中草药抑菌作用研究[J].浙江海洋学院学报:自然科学版，2012，31(2):147-152

[6]王振华，潘康成.不同浓度中药对枯草芽孢杆菌体外生长的影响[J].中国兽医杂志，2007，43(10):44-45.

[7]朱晓慧，唐宝英，刘佳.中药对双歧杆菌生长的影响[J].生物技术，2002，12(4):31-32.

[8]孙力军，陈玲玲，李春保.黄连等六味中药对双歧杆菌和大肠杆菌体外生长的影响[J].中兽医医药杂志，2004（1）:7-8.

[9]孙卉，师俊玲.枯草芽孢杆菌CCTCC M207209对食源性病原菌的抑制作用[J].中国酿造，2009，207（6）:35-37.

[10]朱小玲，杜加法，蔡亚娜，等.动物源大肠杆菌及沙门氏菌抗药性的快速检测[J].中国动物检疫，2010，27(6):40-42.

[11]王小燕，刘丽，陈光亮.二妙散及其衍生方的现代研究概况[J].时珍国医国药，2006，17(1):105-106.

[12]陈建伟，朱萱萱，李祥.神术散方不同提取物体内抗甲型流感病毒作用的研究[J].亚太传统医药，2008，4(10):30-33.

[13]房海波.神术散治疗脾胃病验案举例[J].浙江中医杂志，2012，47（1）:63.

[14]李平兰，时向东，吕燕妮，等.常见中草药对两种肠道有益菌体外生长的影响[J].中国农业大学学报，2003，8(5):33-36.