叶 飞，李 昌，任大勇，，秦艳青，朱 翯，杜寿文，金宁一

（1.吉林农业大学动物科学与技术学院，吉林 长春 130118；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林 长春 130122；3.吉林农业科技学院生物工程学院，吉林 九站 132101）

近年来，微生态制剂应用于畜禽养殖受到广泛关注。它能有效提高畜禽对病原菌的抵抗能力，改善畜禽健康状况。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）作为重要的益生菌在微生态制剂的开发中具有良好前景。

乳酸菌是一类能够利用糖类代谢产生50%以上乳酸的细菌，主要分布于消化道和泌尿生殖道等部位，占消化道有益菌总量的50%以上[1-2]。研究表明，乳酸菌能够恢复或增强肠道稳态，抑制病原菌侵染，促进消化吸收，增强宿主免疫功能[3-4]；近年来人们发现其与黏膜免疫系统相互作用，具备黏膜疫苗载体的潜能[5]。

乳酸菌胞外分泌蛋白，对于乳酸菌环境适应、细胞壁新陈代谢、通信以及定植宿主黏膜部位等方面具有重要作用[6-7]。对其的研究，能够揭示乳酸菌如何适应黏膜局部环境，发挥益生功能改善宿主的微生态平衡。usp 45蛋白是本课题组从乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472培养物中发现的一种大量且稳定表达的胞外分泌蛋白。大量的组成型表达揭示其对于乳酸菌的环境适应及益生功能具有重要作用。本试验从乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因组中克隆获得usp45基因，并进行原核表达与纯化，为进一步研究该蛋白的功能奠定基础，进而为相关微生态制剂和黏膜免疫调节制剂的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472、表达载体，pET-28a本室保存；克隆载体pMD18-T simple Vector、Ex-Taq酶、dNTP MIX、限制性内切酶BamH I、EcoR I，购自TaKaRa（大连）公司；E.coli DH 5α、E.coli BL21（DE3），购自北京全式金生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、小鼠Anti-His Antibody，购自TIANGEN生物公司；质粒DNA小量提取试剂盒，购自AxyGen（杭州）公司；Biospin凝胶回收试剂盒，购自BioFlux公司；Ni-NTA亲和层析柱，购自QIAGEN公司；碱磷酶标记马抗小鼠IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；IPTG/BCIP/NBT，购自Promega公司。

1.2 usp45基因的扩增 由usp 45基因（登录号：M 60178.1）两侧特异性序列设计引物。序列为：FP：5′-ggggATCCATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTA（引入BamH I酶切位点）；RP：5′-gggAATTCCTA gtgatgatgatgatgatg-3′GTTTGGCATCAAGAAAG（引 入EcoR I酶切位点和His-tag标签序列）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

以乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因组DNA为模板，PCR扩增usp 45基因。反应条件：94℃，5 min；94℃变性30 S，58℃退火45 S，72℃延伸2 min，38个循环；72℃，10 min。回收扩增片段，连入克隆载体pMD18-T simple，获得pT-usp 45质粒，转化入E.coli DH 5α。BamH I/EcoR I双酶切鉴定重组质粒，并送上海英潍捷基公司测序鉴定。

1.3 表达质粒的构建 pT-usp 45质粒与表达载体pET-28a经BamH I/EcoR I双酶切，回收片段，T4连接酶16℃连接6 h。将连接产物转化E.coli DH 5α。经BamH I/EcoR I酶切鉴定，获表达质粒pET-28a-usp 45。

1.4 usp45的诱导表达 将pET-28a-usp 45转入E.coli BL21（DE3），于LB（Kan+），37 ℃，220 r/min振荡培养12 h。取50 μL菌液于5 mL LB（Kan+），220 r/min（37 ℃）振荡培养2～3 h，至OD600值为0.6，加入IPTG至终浓度1.0 mmol/L，诱导表达5 h。

1.5 usp 45表达产物的SDS-PAGE分析 IPTG诱导表达的菌液经12 000 r/min离心3 min，收集上清与沉淀制备蛋白样品。上清液：取1 mL冰浴，加入0.34 g（NH4）SO4，4℃静置过夜后，12 000 r/min（4℃）离心25 min，收集沉淀，100 μL细菌裂解液悬起，即得“上清液蛋白样品”。菌体沉淀：100 μL细菌裂解液悬起菌体沉淀，超声波破碎（工作/间歇各15 s，25个循环），12 000 r/min离心10 min后，分别收集上清与沉淀，即得“破碎后上清蛋白样品”与“破碎后沉淀蛋白样品”。

上述蛋白样品，“pET-28a”为空白对照，“pET-28a-usp45未诱导”为阴性对照，10%SDS-PAGE分析。

1.6 usp 45表达产物的Western blot分析 pET-28a为阴性对照，“破碎后沉淀蛋白样品”（见1.5），经SDS-PAGE电泳，用半干转移系统15 v，31 min转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂乳4℃封闭过夜，一抗（抗His小鼠IgG单抗）室温孵育2 h，二抗（碱磷酶标记马抗小鼠IgG）室温孵育1.5 h，BCIP/NBT显色，观察结果。

1.7 usp 45表达产物的层析纯化 制备“破碎后沉淀蛋白”（见1.5），利用usp 45蛋白尾部添加的His-tag标签，由“Ni-NTA亲和层析柱”按照操作说明，纯化usp 45蛋白，并用SDS-PAGE鉴定。

2 结果与分析

2.1 usp45基因的PCR扩增结果 从乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因组，PCR扩增获得usp 45基因，片段长1 371 bp（见图1）。

2.2 克隆质粒pT-usp 45双酶切鉴定与测序鉴定构建的克隆质粒pT-usp 45，经BamH I和EcoR I双酶切可见1 371 bp的目的基因片段和2 671 bp的载体片段，与预期结果一致（见图2）。测序结果显示，pT-usp 45质粒中连接入usp 45基因。克隆质粒pT-usp 45构建成功。

2.3 表达质粒pET-28a-uusp 45的构建与鉴定BamH I和EcoR I酶切pT-usp 45质粒，获得usp 45基因片段，连入表达载体pET-28a，获得表达质粒pET-28a-usp 45。BamH I和EcoR I双酶切可见1 371bp的目的基因片段和5 363 bp的载体片段，与预期结果一致（见图3）。表达质粒pET-28a-usp 45构建成功。

2.4 usp 45表达产物的SDS-PAGE分析 pET-28a-usp 45转化的E.coli BL21（DE3），经IPTG诱导表达5 h。超声波破碎处理，获得“上清液蛋白样品”、“破碎后上清蛋白样品”、“破碎后沉淀蛋白样品”，用10%SDS-PAGE电泳分析（见图4）。在“破碎后沉淀蛋白样品”（泳道7）中有约50 kDa蛋白质分子的大量特异性诱导表达。表明目的蛋白表达成功。

2.5 usp 45表达产物的Western blot分析 “破碎后沉淀蛋白样品”进行Western blot分析；pET-28a空质粒为阴性对照（见图5）。结果显示，重组菌诱导表达usp 45蛋白，usp 45基因原核表达成功。

2.6 usp 45表达产物的层析纯化 “破碎后沉淀蛋白样品”，用Ni-NTA亲和层析纯化，产物经SDS-PAGE分析（见图6）。结果显示，纯化获得约50 kDa蛋白质，即为usp 45蛋白。

3 讨论

乳酸菌在动物黏膜部位发挥益生功能，涉及菌体之间、菌体与其他微生物之间、菌体与宿主黏膜部位细胞之间的相互作用。乳酸菌胞外分泌蛋白在此发挥影响作用。对于乳酸菌胞外分泌蛋白的研究，能够更好理解乳酸菌在肠道内定植的规律；了解其与肠道其他菌群相互作用关系；了解其与宿主胃肠道黏膜细胞相互作用关系[7-9]。

本实验室从乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472培养物中发现一种较大量组成型表达的胞外分泌蛋白。经质谱鉴定与Blast同源分析表明，其即为usp 45蛋白（结果未发表）。稳定的高表达预示其对于乳酸菌的基本生理功能以及乳酸菌与环境、宿主的相互作用具有潜在的重要功能。本试验从乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因组中扩增获得usp 45基因，构建了原核表达质粒pET-28a-usp45，成功进行了原核表达及纯化，为进一步研究usp45蛋白在乳酸菌发挥益生功能中的作用奠定了良好基础。

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