罗 江 蒋霞敏 柳敏海 唐 锋 彭瑞冰

(1. 宁波大学海洋学院, 宁波 315211; 2. 浙江省舟山市水产研究所, 舟山 316000)

卵子发生是个体发育的重要环节之一, 卵子的质量好坏直接影响到受精过程以及受精卵的发育,而卵巢发育程度的好坏直接决定卵子的质量[1]。关于头足类卵子发生和卵巢发育的研究, 国外较多,主要集中在皮氏枪乌贼(Loligo pealei)[2]、巴塔哥尼亚枪乌贼(Loligo gahi)[3]、福氏枪乌贼(Loligo forbesi)[4]、狼乌贼(Lycoteuthis lorigera)[5]、尖盘艾尔斗蛸(Eledone cirrhosa)[6]和真蛸(Loligo vulgaris)[7]等,国内鲜有报道, 仅见曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)[8]、金乌贼(Sepia esculenta)[9]和长蛸(Octopus variabilis)[10], 迄今为止, 未见拟目乌贼(Sepia lycidas)相关报道。

拟目乌贼隶属于软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、鞘亚纲(Coleoidea)、乌贼目(Sepiida)、乌贼科(Sepiidae)、乌贼属(Sepia), 为浅海暖水性较强的底栖种, 20世纪80年代前我国东海有分布, 目前主要分布在南海[11]。因其个体大, 生长快, 具有较高的营养价值和人工养殖前景, 已引起国内外学者的关注[12—23]。2013年5月, 本课题组率先突破了拟目乌贼规模化人工育苗技术, 为其人工养殖的研究奠定了基础。本文采用解剖学和组织学的方法,对水泥池养殖条件下拟目乌贼卵子发生和卵巢发育进行了研究, 阐明了拟目乌贼卵子发生和卵巢发育规律, 可丰富头足类发育生物学理论知识, 对拟目乌贼人工育苗和养殖具有十分重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2013年2—11月进行, 拟目乌贼亲体捕自广东省湛江市硇洲岛海域(21.11°N, 110.24°E), 经自然交配产卵, 在浙江省舟山市水产研究所朱家尖基地进行孵化, 孵化水温为(19—21)℃, 盐度为24—26, 乌贼幼体孵出后在4.0 m×5.0 m×1.2 m的水泥池内进行培育, 培育水温为(20—32)℃, 盐度22—30, 连续充气, 充气头1个/m2。日投饵2次, 投饵种类和投喂量随乌贼个体的增长而改变: 0—45日龄(胴长 0.72—3.83 cm)投喂活糠虾(0.5—1.0 cm), 投喂量(10—20) ind./L; 45—90日龄(胴长3.83—6.52 cm)投喂冰鲜小杂鱼, 切成长条状(1.5 cm×1.0 cm), 日投喂量为体重的18%; 90日龄以后(胴长6.52 cm以上)投喂冰鲜小杂鱼, 切成长条状(3.0 cm×1.0 cm),日投喂量为体重的12%。每天换水1—2次, 换水量80%—100%。

1.2 方法

取样 从刚孵化出膜的小乌贼开始, 1d取样一次, 10d后每隔3天取样一次, 45d后每隔15d取样一次, 每次随机取样10只, 对于肉眼不能分辨性腺的个体, 用波恩氏液整体固定4h后, 切取胴部后段,换新的波恩氏液保存于 4℃冰箱中; 对于肉眼可分辨性腺的个体, 直接取性腺固定, 24h后换新的波恩氏液保存于4℃冰箱中。

组织学切片 酒精梯度脱水, 二甲苯透明,石蜡包埋, KD-2508型轮转式切片机连续切片, 切片厚度(5—8) μm, HE染色, 中性树胶封片, OlympusBX-50型荧光显微镜观察并拍照。

数据测量与处理 记录乌贼日龄(Age)、体重(W)、胴长(ML)和卵巢重(Wo), 细胞直径和细胞核直径直接在显微照片上测量, 按以下公式分别计算核质比(NP)和性腺指数(GSI):

其中, Vn为细胞核的体积, Vc为细胞体积, 由公式V=4/3πR3求得。

2 结果

2.1 卵子发生分期

拟目乌贼卵子发生不同步, 根据细胞形态、细胞大小、滤泡细胞形态和卵黄形成情况可以分为卵原细胞阶段(卵原细胞期)、原生质生长阶段(无滤泡期、单层滤泡期和双层滤泡期)、间质生长阶段(滤泡内折早期、滤泡内折中期和滤泡内折晚期)和营养质生长阶段(卵黄发生早期、卵黄发生晚期和成熟期), 共4个阶段, 10个时期。

卵原细胞阶段 第1期 前期卵原细胞期。前期卵原细胞形状不规则或略呈圆形, 直径为(12—15) μm, 细胞核呈圆形, 直径为(10—12) μm, 细胞核占据整个细胞的绝大部分(图版Ⅰ-1), NP为1.049—1.373。

原生质生长阶段 一部分卵原细胞经过有丝分裂继续保持增殖能力, 另一部分卵原细胞经过减数分裂发育为卵母细胞。此时, 细胞直径和细胞核直径均不断增加, 细胞质继续增多, 根据滤泡细胞的形态和分布的变化将此阶段分为无滤泡期、单层滤泡期和双层滤泡期3个时期。

第 2期 无滤泡期。细胞呈圆形或椭圆形, 直径为(40—170) μm, 细胞核呈椭圆形, 直径为(25—90) μm (图版Ⅰ-2), 细胞外围没有滤泡细胞,NP为0.174—0.492。

第3期 单层滤泡期。细胞呈圆形或椭圆形, 直径为(220—310) μm, 细胞核呈椭圆形, 直径为(100—120) μm (图版Ⅰ-3), NP 为 0.062—0.103。随着卵母细胞体积的增大, 扁平的滤泡细胞(长9—12 μm)开始从卵母细胞的一侧, 逐渐附于细胞膜上, 包围整个卵母细胞, 形成单层滤泡细胞层(图版Ⅱ-1)。

第4期 双层滤泡期。细胞呈圆形或椭圆形, 直径为(290—380) μm, 细胞核呈椭圆形, 直径为(110—130) μm (图版Ⅰ-4), NP 为 0.042—0.073。卵母细胞体积继续增大, 滤泡细胞继续附于细胞膜上,形成双层滤泡细胞层, 内层滤泡细胞变为椭圆形,直径为(7—10) μm, 外层滤泡细胞呈扁平状, 长为(10—15) μm (图版Ⅱ-2)。

间质生长阶段(滤泡内折阶段) 间质生长阶段也可以称为滤泡内折阶段, 主要特征是滤泡细胞开始向卵母细胞内部折叠, 并逐渐占据整个卵母细胞。根据滤泡细胞的分布情况, 可以将此阶段分为早期、中期和晚期3个时期。

第5期 滤泡内折早期。细胞呈圆形或椭圆形,直径为(340—400) μm, 细胞核呈圆形或椭圆形, 直径为(150—170) μm (图版Ⅰ-5), NP 为 0.083—0.094。位于内层的椭圆形滤泡细胞先向卵母细胞内部延伸,形成 8—10个指状突起, 这些指状突起的长度大体一致, 长为(30—40) μm (图版Ⅰ-5、图版Ⅱ-3)。

第6期 滤泡内折中期。细胞呈圆形或椭圆形,直径为(390—470) μm, 细胞核呈圆形或椭圆形, 直径为(160—180) μm (图版Ⅰ-6), NP 为 0.060—0.074。滤泡细胞继续向卵母细胞内部延伸, 占据了整个细胞的一半左右, 指状突起的数量增加到 10—12个,长(80—170) μm 不等, 且有些指状突起出现分支(图版Ⅰ-6), 位于外层扁平的滤泡细胞直径缩短至(8—10) μm, 随着指状突起的深入, 也延伸至卵母细胞内部(图版Ⅱ-4)。

第 7期 滤泡内折晚期。细胞呈椭圆形, 体积急剧增大, 直径为(1000—1200) μm, 细胞核呈椭圆形, 直径为(150—180) μm, 偏向细胞一侧(图版Ⅰ-7), NP为 0.003—0.005。指状突起不断延伸和分支, 相互连接呈网状, 占据整个卵母细胞, 扁平的滤泡细胞消失(图版Ⅱ-5)。

营养质生长阶段 滤泡细胞占据整个卵母细胞后逐渐解体, 细胞核也消失不见, 与此同时, 卵黄物质开始积累, 根据滤泡细胞的分布和卵黄的积累情况, 将此阶段分为卵黄发生早期、卵黄发生晚期和成熟期3个时期。

第 8期 卵黄发生早期。细胞呈椭圆形, 直径为(1500—1800) μm, 网状的滤泡细胞从卵母细胞的中间开始解体(图版Ⅰ-8), 解体的滤泡细胞边界不明显, 直径为(7—10) μm, 相互堆积(图版Ⅱ-6), 细小的颗粒状卵黄物质相互聚集, 呈小块状, 被HE染成淡蓝色(图版Ⅰ-8)。

第9期 卵黄发生晚期。细胞体积急剧增大, 呈椭圆形, 直径为(2300—2900) μm, 大部分滤泡细胞已经解体, 整个卵母细胞充满了卵黄物质, 呈块状,被染HE成橘红色(图版I-9)。

第10期 成熟期。成熟卵子呈黄色透明的椭圆形, 直径为(6000—7000) μm, 内充满了大量卵黄,切片时容易破碎, 因而未获得组织学结构。

2.2 卵巢发育分期

根据卵巢外观形态、性腺指数变化和切面上各期细胞所占的比例, 将拟目乌贼卵巢发育分为形成前期、形成期、小生长期、大生长期、成熟前期和成熟期6个时期。

Ⅰ期 形成前期 乌贼日龄 23—31d, 体重(3.03—4.82) g, 胴长(2.43—3.22) cm, 性腺肉眼不可见, 组织切片观察到卵巢位于胴体基部, 切面上生殖细胞均为卵子发生第1期的细胞, 少量被HE染成深蓝色的扁平滤泡细胞散布于卵巢中(图版Ⅲ-1、表 1)。

Ⅱ期 形成期 乌贼日龄 31—45d, 体重(4.82—8.56) g, 胴长(3.22—3.83) cm, 性腺位于体腔后部, 包被于体腔膜中, 肉眼不容易观察到, 呈乳白色, 细条状, 长约 4 mm, 重(0.01—0.02) g, 性腺指数为 0.16—0.28, 组织切片观察, 卵巢内生殖细胞以卵子发生第 2期细胞为主, 占整个切面的83.66%, 还分布着少量第 3期(13.96%)和第 1期(2.38%)的细胞(图版Ⅲ-2、表 1)。

Ⅲ期 小生长期 乌贼日龄 45—150d, 体重(8.56—133.81) g, 胴长(3.83—11.20) cm, 肉眼明显可见卵巢呈乳白色, 扁平状, 紧贴体腔膜, 大小(6—8) mm, 重(0.02—0.23) g, 性腺指数为 0.12—0.26, 组织切片观察, 卵巢内生殖细胞以卵子发生第4期细胞为主, 占整个切面的50.01%, 其次为第3期细胞(36.33%), 仍然可见少量第2期(11.34%)和第1期(1.09%)细胞, 且切面上出现了部分退化吸收的卵母细胞, 占整个切面的1.23% (图版Ⅲ-3、表1)。

Ⅳ期 大生长期 乌贼日龄 150—180d, 体重(133.81—256.34) g, 胴长(11.20—13.55) cm, 卵巢呈乳白色, 扁平状, 肉眼可观察到卵巢表面具有凹凸不平的卵粒, 此期卵巢开始快速增长, 大小(12—18) mm, 重 (0.23—1.56) g, 性 腺指 数 为0.17—0.72, 组织切片观察, 卵巢内生殖细胞以卵子发生第6期细胞为主, 占整个切面的50.27%, 其次为第5期细胞(18.83%), 第1期细胞不再出现(图版Ⅲ-4、表1)。

Ⅴ期 成熟前期 乌贼日龄 180d后, 体重达256.34 g以上, 胴长达13.55 cm以上, 卵巢继续增长, 乳白色, 葡萄状, 大小(20—25) mm, 重 1.56 g以上, 性腺指数 0.65以上, 肉眼可见椭球形的卵母细胞呈串排列。组织切片观察, 卵巢内生殖细胞以卵子发生第 8期细胞为主, 占整个切面的 61.85%,退化吸收的卵母细胞增多, 占整个切面的2.05% (图版Ⅲ-5、表1)。

Ⅵ期 成熟期 成熟卵巢从亲体中获得, 此时乌贼已经性成熟, 体重(950.33—2010.28) g, 胴长(20.80—27.75) cm, 卵巢呈淡黄色, 葡萄状, 充满整个胴体后部, 重(31.35—75.23) g, 性腺指数为2.82—4.05, 淡黄色的成熟卵子游离到生殖腔中, 偶见的未成熟卵子呈乳白色(图版Ⅲ-6、表1)。

3 讨论

3.1 关于性成熟和繁殖周期

头足类繁殖周期不同种类之间存在较大差异,韦柳枝等认为金乌贼为一年性成熟, 繁殖周期为一年[24]; Goff和 Daguzan研究发现乌贼(Sepia officinalis)有两种繁殖群体, 第一种群体的数量和个体均较小, 繁殖周期为一年, 第二种群体的数量和个体均较大, 繁殖周期为 2年[25]; 曼氏无针乌贼在自然条件下一年只繁殖一次, 而在人工养殖条件下, 春季产出的幼体在秋季即可达到性成熟, 一年有两次繁殖期[26]。本实验表明, 拟目乌贼孵化出膜后, 经过 4—6个月的水泥池养殖, 平均体重为 256.34 g,最大体重可达到 457.08 g, 大部分个体的卵巢发育至第Ⅳ期, 个别已发育至第Ⅵ期, 达到性成熟, 因此我们推测人工养殖条件下拟目乌贼一年可达到性成熟, 繁殖周期为一年。一般来说头足类达到性成熟后, 即交配、产卵, 随后大量死亡, 特别是曼氏无针乌贼性早熟现象普遍, 养殖3—4个月, 长至50 g左右就性早熟, 交配产卵, 伴随大量死亡, 这严重挫伤了养殖户的积极性, 阻碍了乌贼养殖业的发展,而拟目乌贼生长快, 养殖 4—6个月就可长至250—500 g, 达到商品规格, 而且只出现个别性成熟, 这为养殖户带来了福音。

表1 拟目乌贼卵巢发育不同时期切面上各期细胞所占的比例Tab. 1 Percentage of each oocyte at the sections during ovaries development in Sepia lycidas

3.2 关于卵子发生和卵巢发育的分期

关于头足类卵子发生的分期, 不同学者的分类依据不尽相同。Bottke[27]根据滤泡细胞形态变化, 将锥异尾枪乌贼(Alloteuthis subulata)的卵子发生分为了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3个阶段, 而Selman和Arnold[2]根据滤泡细胞形态变化将皮氏枪乌贼卵子发生分为了Ⅰ—Ⅴ 5个阶段, Boyle和Chevis[6]根据卵黄发生情况将尖盘艾尔斗蛸卵子发生也分为了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3个阶段, 蒋霞敏等[8]和李来国[10]根据细胞大小、细胞核形态和滤泡细胞形态变化分别将曼氏无针乌贼和长蛸卵子发生分为卵原细胞期、卵母细胞期、成熟期和退化期4个阶段。本文综合根据细胞形态、细胞大小、滤泡细胞形态和卵黄发生情况, 将拟目乌贼卵子发生分为卵原细胞、原生质生长、间质生长和营养质生长 4个阶段, 这与 Laptikhovsky和Arkhipkin[3]对巴塔哥尼亚枪乌贼及Hoving和 Laptikhovsky[5]对狼乌贼卵子发生的分期类似。

关于头足类卵巢发育的分期, 尚未有统一的标准。Perez和Haimovici[28]根据卵巢的厚度、颜色和卵细胞直径将大爱尔斗蛸(Eledone Massyae)卵巢发育分为了Ⅰ—Ⅳ4个时期, Estefanell等[7]根据性腺指数变化将真蛸卵巢发育也分为了Ⅰ—Ⅳ4个时期,Boyle和 Chevis[6]根据卵黄发生情况, 将尖盘艾尔斗蛸卵巢发育分为了卵黄发生前期、卵黄发生早期、卵黄发生晚期和成熟期4个时期, Gabr等[29]根据卵巢的组织学结构将虎斑乌贼(Sepia pharaonis)和多氏乌贼(Sepia dollfusi)卵巢发育分为未成熟期、成熟期、产卵前期和产卵期 4个时期, 本文根据卵巢的外观形态、性腺指数变化和切面上各期细胞所占的比例, 将拟目乌贼卵巢发育分为形成前期、形成期、小生长期、大生长期、成熟前期和成熟期6个时期,这种分期方式综合了形态学、组织学和数据三方面依据, 比较全面, 可作为日后研究头足类卵巢发育分期的一个参考标准。

3.3 关于滤泡细胞的变化与卵黄的形成

滤泡细胞伴随着卵母细胞发育的整个过程, 其形态和分布的变化是卵子发生分期的重要依据。关于滤泡细胞的起源, Nakamura[30]、张耀光等[31]和牟振波等[32]均认为滤泡细胞起源于非生殖细胞, 由卵巢基质分化而来, 而Broow[33]和Bolognari等[34]认为滤泡细胞起源于生殖细胞, 由早期卵原细胞分化而来, 在本研究中, 拟目乌贼滤泡细胞和卵原细胞同时出现于卵巢发育的第Ⅰ期, 滤泡细胞形态和大小均不同于卵原细胞, 因而我们认为拟目乌贼滤泡细胞起源于非生殖细胞, 由卵巢基质分化而来。在拟目乌贼卵子发生过程中, 滤泡细胞经历了一个由包围卵母细胞的扁平单层, 转变为外层扁平内层椭圆形的双层, 内折形成指状突起, 直至占据整个卵母细胞的网状结构, 最后解体消失的过程, 这与曼氏无针乌贼[8]和长蛸[10]卵子发生过程中滤泡细胞的变化相类似, 在巴塔哥尼亚枪乌贼[3]卵子发生过程中滤泡细胞经历了鱼鳞状和圆柱形, 这与本文描述的滤泡细胞经历了扁平状和椭圆形是相似的, Selman和 Arnold[2]研究发现皮氏枪乌贼滤泡细胞在卵子发生过程中是逐渐拉长的, Laptikhovsky和Arkhipkin[3]、Hoving 和 Laptikhovsky[5]也得到了类似的结果, 但本研究发现, 拟目乌贼外层扁平滤泡细胞先拉长后缩短, 而内层椭圆形的滤泡细胞直径变化不大。

关于滤泡细胞的功能, 众说纷纭, 龚启祥和杜立勤[35]、张耀光和谢小军[31]认为滤泡细胞参与卵膜的形成, Grier[36]认为滤泡细胞具有合成和运输外源性卵黄前体物质的作用, 而Selman和Arnold[2]认为滤泡细胞同时具有合成和分泌卵膜物质和卵黄前体物质的作用, Thiaw和Mattei[37]认为滤泡细胞对退化吸收的卵母细胞还具有二次包裹和吞噬的功能。在本文中, 卵黄的形成与滤泡细胞解体同时发生, 推测滤泡细胞解体前合成了大量卵黄前体物质, 在解体时分泌到卵母细胞中, 从而在短时间内合成了大量卵黄颗粒, 因而我们认为滤泡细胞参与了卵黄的合成,这与Bottke[27]认为卵黄由滤泡细胞产生的观点一致。

3.4 关于细胞大小的变化

卵细胞的体积在卵子发生过程中发生了较大的变化, 不同物种之间这种变化也不同, 表 2比较了不同物种卵子发生过程中卵细胞直径的变化, 可看出各个时期卵细胞直径在不同物种之间具有较大差异, 且在卵子发生过程中, 卵细胞的直径会出现跳跃性的增长, 曼氏无针乌贼[8]卵细胞跳跃性增长出现在第6—7期, 此期是滤泡细胞大量内折占据整个卵母细胞的时期, 巴塔哥尼亚枪乌贼[3]和狼乌贼[5]卵细胞跳跃性增长出现在第10期, 此期是卵黄大量合成的时期, 拟目乌贼卵细胞出现了两次跳跃性增长, 第一次出现在第 7期, 即滤泡细胞大量内折期,第二次出现在第 9—10期, 即卵黄大量合成期, 可见滤泡细胞的增长和卵黄的合成是卵细胞体积增长的主要动力。卵子的大小可能会影响精卵的结合以及受精卵的发育, 据悉拟目乌贼受精卵产出时大小为 17.1 mm×39.7 mm, 孵化出的乌贼幼体胴长为8.0 mm, 而曼氏无针乌贼[38]受精卵产出时大小仅有5.5 mm×10.0 mm, 孵化出的乌贼幼体胴长仅有4.0 mm,这与拟目乌贼卵子较曼氏无针乌贼大是密切相关的。

表2 几种乌贼卵子发生过程中卵细胞直径变化的比较(单位: μm)Tab. 2 Comparison of oocyte diameter of several cuttlefish during Oogenesis (Unit: μm)

细胞核的变化主要体现在体积和位置上, 在拟目乌贼卵子发生过程中, 细胞核体积不断增长至第5期, 之后保持在(150—180) μm左右, 位置由细胞中央偏移到一侧, 随着滤泡细胞的解体而逐渐消失,这与皮氏枪乌贼[2]、巴塔哥尼亚枪乌贼[3]和狼乌贼[5]卵子发生过程中细胞核的变化相类似, 而曼氏无针乌贼[8]卵子发生过程中细胞核消失之前体积有一个减小的过程。在整个卵子发生过程中, 核质比是不断减小的, 这与倪海尔和杜立勤[39]认为卵母细胞越趋向成熟, 核质比越小的观点一致。