李辉超, 王大雷, 闫 伦, 楚菲菲, 彭 湃, 夏 炜

实验研究

兔耳增生性瘢痕中Th1、Th2细胞相关趋化因子的表达及意义

李辉超, 王大雷, 闫 伦, 楚菲菲, 彭 湃, 夏 炜

目的研究辅助性T淋巴(Th)细胞亚群Th1、Th2细胞相关趋化因子CXCL0/IP-10、CXCL12/SDF-1，CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1α、CCL5/ RANTES、CCL7/MCP-3在兔耳增生性瘢痕形成过程中的表达变化及意义。方法选取14只新西兰大耳白兔，制作兔耳增生性瘢痕模型及兔背部正常性瘢痕模型。于术后第21、28、35、42、49、56、63天空气栓塞法分别随机处死2只兔子，采集瘢痕标本，行HE染色，测量并计算瘢痕增生指数；行Real-time PCR检测CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7的表达。结果HE染色可见兔耳增生性瘢痕组、兔背部正常性瘢痕组类似人增生性瘢痕、正常性瘢痕的镜下表现。瘢痕增生指数显示，rHS组于术后第28天增生程度达到高峰(P<0.05)。Real-time PCR结果示，Th2细胞相关趋化因子CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13在兔背部正常性瘢痕组基本无表达，而在兔耳增生性瘢痕组存在长时间高表达(P<0.05)，Th1细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12在兔耳增生性瘢痕组长时间高表达，而在兔耳增生性瘢痕组处于低表达或不表达(P<0.05)。结论在兔耳瘢痕增生过程中Th2细胞相关趋化因子CCL2、CCL3、CCL5、CCL7存在长时间的高表达，Th1细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12低表达或无表达，提示瘢痕局部趋化因子的表达水平可能对Th1、Th2细胞在增生性瘢痕中的差异性表达起作用。

增生性瘢痕模型； 趋化因子； Th1细胞； Th2细胞； 兔

增生性瘢痕是整形外科的常见疾病，其确切发病机制目前尚不清楚，但公认为瘢痕增生是多种因素共同作用的结果，其中免疫因素占有十分重要的作用[1]。已有研究表明，辅助性T淋巴(Th)细胞是增生性瘢痕中的主要免疫细胞，其亚群Th1、Th2细胞与纤维化有密切关系[2-8]。趋化因子独特的趋化特性在Th细胞向瘢痕组织浸润的过程中发挥了重要作用[9-10]。自2012年8月至2013年3月，笔者研究通过检测兔耳增生性瘢痕中Th1、Th2细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7的表达水平，从趋化因子角度探讨Th1、Th2细胞在增生性瘢痕中的表达及其相关趋化因子在瘢痕发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康成年无外伤新西兰大耳白兔14只，体质量2.5～3.0 kg，雌雄不限，购自第四军医大学实验动物中心，分笼饲养。

1.2 实验材料

脱毛剂(8%的硫化钠乙醇溶液)；HE染色由第四军医大学病理科实验室提供；Trizol Reagent由上海生工提供；引物由北京奥科有限公司合成；反转录试剂盒、纯化扩增试剂盒及荧光定量试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 制作兔耳增生性瘢痕模型及兔背部正常瘢痕模型 术前用脱毛剂去除兔背部的兔毛。手术步骤：首先用3%戊巴比妥钠于兔耳缘静脉缓慢推注，全身麻醉(1.5 mg/kg)；在无菌条件下，避开可见血管，参照文献[9]于每只兔耳腹侧制作直径1.0 cm去除皮肤全层及软骨膜的圆形创面，左右耳各4个，兔背部制作直径1.0 cm去除皮肤全层至筋膜层的圆形创面6个。各创面间距约1.0 cm，最后电凝止血。每只兔有8个耳部创面，6个背部创面。共建模14只兔。术后创面暴露，前3 d每天碘伏消毒创面，待其自行愈合。兔耳增生性瘢痕(rabbit ear hypertrophic scar, rHS)组共有112个创面，兔背部正常性瘢痕(rabbit dorsal normal scar, rNS)组共有84个创面。

1.3.2 采集标本 随机收集2只兔术中去除的正常兔耳及兔背部皮肤组织为实验正常组织对照。术后第21、28、35、42、49、56、63天于同一时间点以空气栓塞法各随机处死2只兔，沿每个瘢痕边缘外周的0.5 cm 处环形切下，每个标本沿通过瘢痕最凸点直径一切为二。正常皮肤组织及所有瘢痕标本一半，即刻用4%多聚甲醛固定24～48 h，石蜡包埋，行HE染色；另一半于-80 ℃冰箱保存，以备提取RNA行RT-PCR 检测。

1.3.3 计算瘢痕增生指数 根据HE染色切片显微镜下所见，瘢痕最凸点至耳软骨表面垂直距离与瘢痕周围正常皮肤至耳软骨表面垂直距离的比值，即为计算瘢痕增生指数(scar elevation index, SEI)。瘢痕增生越明显，瘢痕指数越大，一般 SEI >1.6可以认为存在明显的瘢痕增生。用IPP 软件测量并计算SEI。

1.3.4 Real-time PCR 检测 如表1示设计引物。按照标本顺序分别切取100 mg 组织，液氮冷冻并研磨后加入1 ml Trizol提取总RNA，紫外分光光度计检测其纯度及浓度，纯化并去除基因组DNA后反转录为 cDNA。收集所有标本后，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，通过 MJ Research Option 2荧光定量PCR 仪，对Th1、Th2相关趋化因子CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7的表达进行Real-time PCR检测。

2 结果

2.1 瘢痕模型大体观察

术后可见rHS组与rNS组随时间改变而呈现不同程度的变化。术后21 d(图1)：同一只兔身上，rHS组明显增厚，色红，触之较硬，创面中心增生最严重；rNS组表面无明显隆起，触之质软，瘢痕颜色淡红接近周围肤色。rHS组于术后28～35 d瘢痕增生程度达到高峰，而rNS组随时间逐渐消退。

2.2 HE染色结果

与正常皮肤比较，21 d HE染色显示(图2)：rHS组真皮层明显增厚，含大量致密粗大的胶原纤维，排列混乱，其间可见炎性细胞及新生血管，与人增生性瘢痕病理学表现类似。 rNS组真皮层增生不明显，细胞外基质沉淀少，其结构较疏松，胶原纤维多为平行排列，成纤维细胞数量少，类似人正常性瘢痕表现。

2.3 瘢痕增生指数

rHS组于术后第28天增生达高峰；rNS组无增生指数，术后第21、28、35、42、49、56、63天各时间点SEI值如表2所示。

2.4 Real-time PCR 检测结果

Real-time PCR结果示，Th2细胞相关趋化因子CCL2、CCL3、CCL5、CCL7在rHS组存在长时间高表达，而在rNS组处于低表达或无表达(P<0.05)；Th1细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12在rHS组基本无表达，而在rNS组却存在较长时间高表达P<0.01，差异有显著统计学意义(图3)。

3 讨论

3.1 动物模型的讨论

兔耳腹侧增生性瘢痕模型为目前较成熟和广泛应用的的动物瘢痕模型，本实验即采用此模型为实验组。有研究发现，兔耳背侧创面也可形成增生性瘢痕，但瘢痕成功率低[11]。而兔背部可形成正常性瘢痕。故本实验选择兔背部瘢痕作为正常性瘢痕对照组。避开创伤早期阶段，选择在增生性瘢痕的增生期内，通过长期性、连续性的研究来观察这两个部位各种因子的表达变化，以探索增生性瘢痕的发生机制。

3.2 增生性瘢痕发生机制研究

病理性瘢痕的发生不仅仅是局部的问题，还受到了来自全身的免疫细胞的调节[1]。已有研究表明，辅助性T淋巴(Th)细胞是病理性瘢痕中的主要免疫细胞[2]。Th细胞亚群中的Th1和Th2细胞与瘢痕的纤维化形成有着密切的关系。Th1细胞有减轻纤维化的作用，而Th2细胞则有强的促纤维化的作用[3-6]。Th1细胞产生的主要细胞因子IFN-γ可抑制胶原合成，增加胶原酶的表达和活性，从而促进胶原改建。因此，在以Th1细胞为主的免疫反应中，往往出现大量的细胞凋亡和细胞外基质降解现象[4]。Th2细胞产生多种细胞因子，其中IL-4是强促纤维化因子[5]。Tredget等[6]研究发现，烧伤后增生性瘢痕的形成与过度增强的Th2反应有关，表现为血清中IL-4水平明显升高。有一些研究者试图通过改变细胞因子的水平，如向瘢痕局部注射IFN-γ、IFN-α2b来进行治疗和预防复发，但均未取得效果。说明单独改变某些细胞因子的水平不能达到治疗和预防瘢痕增生的作用[12]。因此，单纯改变局部的成纤维细胞或细胞因子的水平，难以达到治疗瘢痕的疗效，只有降低或阻断循环血液来源的免疫细胞与病变局部细胞间的相互作用，才更有希望取得疗效。在导致瘢痕外周血中的免疫细胞向病变局部组织募集的过程中，趋化因子以其独特的趋化特性发挥了重要作用[8-9]。趋化因子是由局部组织产生的一类具有趋化活性的小分子蛋白质。组织受到创伤后局部产生多种趋化因子，与免疫细胞上相应的趋化因子受体结合后传递信号，加固免疫细胞与内皮细胞之间的黏附，促进免疫细胞由血液向组织局部的渗出和活化；免疫细胞进入靶组织后，局部趋化因子的浓度梯度使其趋化到炎症部位，进而分泌一系列炎症细胞因子，参与病理损伤过程，最后形成正常性或病理性瘢痕。趋化因子与趋化因子受体间并非一一对应，多种趋化因子对Th1、Th2细胞都有趋化作用，但最终却导致机体正常性瘢痕、病理性瘢痕两种愈合方式。是否由于趋化因子的异常表达最终导致了瘢痕局部组织Th1、Th2细胞表达水平的差异性，形成病理性瘢痕？因此，本研究通过RT-PCR技术从基因水平长期而连续地检测了正常性瘢痕与增生性瘢痕组织中多种趋化因子(CXCL10、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13)的表达水平，来进一步探讨瘢痕发生机制。CXCL10 (IP-10)可与Th1细胞表面受体CXCR3特异性结合，是Th1细胞的强力募集者，参与Thl介导的细胞免疫反应[13]。本研究结果显示，CXCL10在瘢痕增生过程中基本无表达，导致Th1细胞在瘢痕增生中表达处于劣势。CXCL12(SDF-1)其唯一受体为 CXCR4，在Th1和Th2细胞表面都表达。Clissi等[14]采用体外实验得出慢性炎症反应中，CXCL12倾向于选择性的趋化Th1细胞，对Th2的作用较弱。本实验结果测得CXCL12在正常性瘢痕形成中呈高表达、在增生性瘢痕中处于低表达，亦使Th1细胞的表达受到抑制。CCL2(MCP-1)其主要受体为CCR2，CCR2在Th1和Th2细胞表面均表达。已有研究表明[15]在纤维化相关疾病中CCL2呈高表达，本实验结果也证实在兔耳增生性瘢痕中CCL2长期处于高表达。其机制可能为在内环境的作用下，CCR2高表达于Th2细胞表面，在CCL2趋化作用下呈Th2细胞极向化反应。CCL5(RANTES)其受体为CCR5及CCR3。CCR5位于Th1细胞表面，CCR3位于Th2细胞表面。本实验结果显示，在兔耳增生性瘢痕中CCL5处于高表达。提示在纤维化过程中CCL5倾向于趋化Th2细胞，对Th1细胞作用较弱。Moore等[16]在鼠肺纤维化实验中，用CCR2受体阻断剂阻断CCR2受体后，肺纤维化明显减轻，而使用CCR5受体阻断剂未发现明显变化。CCL3/MIP-1α与CCL7/MCP-3的主要受体 CCR1为Th1、Th2细胞共同表达受体。刘春玲等[17]使用免疫组化证实甲状腺相关纤维化眼病，眼眶的成纤维细胞上CCR1处于高表达，提示CCR1与疾病的纤维化病变有关。本实验的结果也提示，CCL3、CCL7在瘢痕增生过程中可能主要参与了Th2细胞的趋化。

表1 PCR引物的设计

表2 rHS组各时间点的SEI值

图1 手术时创面制作及术后21 d时大体观察 a. 兔耳瘢痕 b. 兔背部瘢痕 c. 术后21 d时兔耳瘢痕 d. 术后21 d时兔背部瘢痕图2 正常组织及术后21 d标本观察(HE ×40) a. 兔耳正常组织 b. rHS组术后21 d c. 兔背部正常组织 d. rNS组术后21 d图3 CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CXCL10、CXCL12在rHS组及rNS组表达情况

Fig1 Preparation of wound during the operation and gross observation after operation at 21 days. a. rHS model. b. rNS model. c. postview of rHS model at 21 days. d. postview of rNS at 21days.Fig2 Histological observation of normal tissue and postoperative specimens at 21 days (HE ×40). a. normal ear skin. b. postview of rHS model at 21 days. c. normal dorsal skin. d. postview of rNS at 21 days.

Fig3 The expressions of CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CXCXL10 and CXCL12 in the rHS and the rNS groups.

综上所述，瘢痕局部组织的CXCL10、CXCL12为Th1细胞相关趋化因子，CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13为Th2细胞相关趋化因子。增生性瘢痕形成过程中局部组织中Th1细胞相关趋化因子CXCL10、CXCL12的低表达，Th2细胞相关趋化因子CCL2、CCL3、CCL5、CCL7、CCL13的高表达，最终导致了Th1、Th2细胞在局部的差异性表达。Th1细胞低表达，Th2高表达，并最终向Th2方向极化，导致了增生性瘢痕的病理改变。实验结果进一步阐述了病理性瘢痕的可能发病机制，提示我们可以通过调节机体免疫途径中重要的Th1、Th2细胞相关趋化因子的表达水平，如采取小分子趋化因子受体阻断剂、中和抗体、免疫调节剂等方法来发挥调节免疫细胞与局部成纤维细胞的相互作用，从而达到防治瘢痕的作用。目前，小分子趋化因子受体拮抗剂、中和抗体、免疫抑制剂，由于具有作用靶点更准确等优点，在临床上已越来越显示出其良好的应用前景。本实验进一步阐明了T细胞来源的信号在瘢痕增生中的作用，对今后瘢痕防治方法中干预T淋巴细胞的趋化和活化的治疗模式，提供了大量的数据依据及研究背景，有必要进一步深入研究。

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ExpressionofTh1/Th2relatedchemokinesinrabbitearhypertrophicscarmodel

LIHui-chao,WANGDa-lei,YANLun,etal.
(InstituteofPlasticSurgery,XijingHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

ObjectiveTo investigate the expression of Th1/Th2 related chemokines, CXCL0/IP-10, CXCL12/SDF-1, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES and CCL7/MCP-3 in rabbit ear hypertrophic scar.MethodsFourteen New Zealand white rabbits were selected to publish the hypertrophic scar (rHS) and normal scar (rNS) models on the ear and the back respectively. All the tissue specimens were harvested at 21, 28, 35, 42, 49, 56 and 63 days after operation. Two rabbits were killed randomly by air embolism. Hematoxylin eosin staining was performed after fixing to observe morphological differences and then to measure SEI. The expression of CXCL10, CXCL12, CCL2, CCL3, CCL5 and CCL7 was detected by RT-PCR.ResultsThe sections of HE showed the microscopic structures of rabbit hypertrophic scar and normal scars like that of human scares. The SEI in the rHS group showed the degree of proliferation peaked at 28 days. The mRNA level of Th2 cell related chemokines CCL2, CCL3, CCL5 and CCL7 were significantly higher in the rHS group while almost no expression in the rNS group. The mRNA level of Th1 cell related chemokines CXCL10 and CXCL12 in the rHS group had no expression while was significantly higher in the rNS group (P<0.05).ConclusionCompared with the rNS group, the over-expression of Th2 cell related chemokine CCL2, CCL3, CCL5 and CCL7 and the low-expression of Th1 cell related chemokine CXCL10 and CXCL12 in the rHS group suggests that the level of chemokines may play an important role in the pathogenesis and in Th1/Th2 cell distribution of hypertrophic scar.

Hypertrophic scar model; Chemokine; Th1 cell; Th2 cell; Rabbit

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.04.015

R332；R619.6

A

1673-7040(2014)04-0230-05

2013-12-06)

国家自然科学基金资助项目(81272118)

710032 陕西 西安，第四军医大学西京医院 全军整形外科研究所(李辉超,王大雷,楚菲菲,彭 湃,夏 炜)；康华医院 烧伤整形外科(闫 伦)

李辉超(1986-)，女，河北石家庄人，硕士研究生.

夏 炜，710032，第四军医大学西京医院 全军整形外科研究所，电子信箱:weixia@fmmu.edu.cn