张许萌，王林林，任浩，何琪杨，陈汝贤，解云英



以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的基因表达上调剂筛选模型的建立与初步应用

张许萌，王林林，任浩，何琪杨，陈汝贤，解云英

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所微生物化学室

建立以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的高通量筛选模型，用于胰岛新生相关蛋白基因表达上调剂的筛选。

以叙利亚金黄地鼠基因组 DNA 为模板扩增胰岛新生相关蛋白核心启动子序列，克隆至pGL4.17 质粒载体构建重组质粒。采用脂质体介导的方法将重组质粒和内参质粒 pRL-TK 共转染金黄地鼠胰岛 β 细胞 HIT-T15，双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶的表达活性。对瞬时转染条件进行优化，以豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯作为阳性对照来评价模型的有效性，并利用该细胞模型对本研究所的化合物库进行筛选。

构建了重组荧光素酶报告基因质粒 pGL4.17-INGAP，并成功转染 HIT-T15 细胞株。对模型进行优化后，应用阳性对照对其进行评价，Z' 因子为 0.57，适用于进行高通量筛选。用该模型筛选了本所化合物库，其中白藜芦醇显示出较好的上调作用，EC50为 1.6 μg/ml。

成功建立了以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的基因表达上调剂筛选模型。

转录启动子； 药物评价，临床前； 胰岛新生相关蛋白

糖尿病是以高血糖为主要特征的代谢性疾病，并伴有严重的并发症，降低了患者的生活质量[1]，胰岛 β 细胞过度凋亡、功能减退是糖尿病发病的重要环节[2]。研究发现，在胰腺发生发育过程中，将健康胰腺部分切除或胰管结扎后，某些诱发因子能够刺激胰腺导管前体细胞分化成胰岛 β 细胞，胰岛功能可以通过 β 细胞再生得以部分恢复，这一过程即胰岛新生[3-4]。

基础研究已发现了一些诱发胰岛新生的先导物，其中胰岛新生相关蛋白（islet neogenesis associated protein，INGAP）是在寻找具有胰岛新生活性的内源性分子过程中发现的第一个治疗性候选物[5]，在胰岛新生过程中发挥着重要作用。已有动物实验表明，INGAP 能够促进 β 细胞的增殖，逆转I型糖尿病大鼠的高血糖症状[5-6]；另外，相关II期临床研究证明，INGAP 能够促进内源性胰岛素分泌，改善血糖控制[7]。因此，INGAP 是一个潜在的安全有效的糖尿病治疗新靶点。

本研究以 INGAP 基因启动子为靶点，建立以细胞为基础的、能够检测其转录活性的筛选模型，以期发现能够特异性上调 INGAP 表达的活性化合物，为糖尿病的治疗提供新的候选药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和质粒 金黄地鼠胰岛 β 细胞株 HIT-T15（ATCC CRL-1777）购自中国科学院昆明细胞库；DH5α 感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司；pGM-T 购自天根生化科技（北京）有限公司；pGL4.17（luc2/Neo）和 pRL-TK 由本所生物工程室惠赠。

1.1.2 工具酶和主要试剂 Ex Taq 酶、T4 DNA连接酶等购自宝生物工程（大连）有限公司；RPMI 1640 培养基为美国 Thermo 产品；胎牛血清为美国 Gibco 公司产品；血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒、质粒小提试剂盒（离心柱型）、普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒等购自天根生化科技（北京）有限公司；Dual-Glo 双荧光素酶检测试剂盒（E2920）为美国 Promega 公司产品；豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯（PMA）购自美国 Sigma 公司。

1.1.3 仪器 TC-312 型基因扩增仪购自英国 Techne 公司；ChemiImager5500 化学发光成像仪购自美国 Biorad 公司；Q5000 微量紫外分光光度计为美国 Quawell Technology Inc 公司产品；EnVision 多功能微孔板检测仪为美国 Perkin Elmer 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DNA 目的片段的体外扩增 从叙利亚金黄地鼠肝组织抽提基因组DNA，并以此为模板，根据 GenBank 收录的 INGAP 基因全序列（AY184211.1）和启动子调控元件所在位置[8]设计引物，上游引物5'CTGTAACCAGATGA TACGATGC 3'（下划线表示 XhoI酶切位点），下游引物5' AGTTTCAGAGTGCTGCCTTG 3'，扩增位于 2177 ~ 3256 bp 区域的 INGAP 基因启动子序列 1080 bp。PCR 体系反应条件为 94 ℃变性4 min；94 ℃变性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 70 s（30 个循环）；72 ℃延伸 10 min。

将 PCR 扩增产物纯化回收，与 pGM-T 载体连接，转化至DH5α 感受态细胞进行扩增，蓝白斑法挑选阳性转化子。扩增质粒，提取并测序鉴定，选取与 GenBank AY184211.1 序列同源性 100% 的克隆，命名为 pGM-INGAP。

1.2.2 重组质粒的构建和鉴定 限制性内切酶I与II酶切pGM-INGAP 和 pGL4.17，将目的片段与线性 pGL4.17 连接，即把 INGAP 基因启动子序列定向插入到 pGL4.17 载体的荧光素酶报告基因上游，命名为 pGL4.17-INGAP。重组质粒转化DH5α 进行扩增，提取质粒并鉴定。

1.2.3 瞬时转染条件的建立与优化 HIT-T15 细胞在含 10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养基中培养，每隔 2 ~ 3 天用 0.25% 胰酶消化传代。在96 孔板中接种细胞，隔天待细胞贴壁生长融合度达到 90% 时，按照 Lipofectamine 2000 说明书将 pGL4.17-INGAP 和内参质粒 pRL-TK 共转染细胞，6 h 后用全培养基换掉转染液，继续培养 12 ~ 48 h 检测荧光素酶的表达活性，并对影响转染效率的因素如质粒与脂质体比例等条件进行优化。

1.2.4 双荧光素酶活性测定 采用双荧光素酶报告基因系统，以组成性活性的pRL-TK 作为内对照，使重组质粒的测量结果正态化。具体方法是：将检测试剂置于室温平衡后，按照说明书混合配制，待测板中弃去上清，用 PBS 洗 3 次后每孔加20 μl 细胞裂解液（PLB）裂解细胞 20 min，加入萤火虫荧光素酶 50 μl，通过 Envision 微孔板多功能检测仪读取荧光素酶活性数值。然后每孔加海肾荧光素酶混合液 50 μl，立即检测，读数。

1.2.5 阳性对照的建立、模型评价及药物筛选 为评价所构建模型的有效性，在转染 6 h 后，将已知的阳性化合物 PMA 作用于细胞模型，12 ~ 48 h 后检测荧光素酶的表达活性，以此来考察 PMA 在该模型上的作用。

采用 Z'因子法评价该模型对高通量筛选的可用性，根据公式Z' = 1 – 3（σc++ σc-）/（μc+– μc-）计算 Z'因子值，其中 μc-和 σc-分别为阴性对照的平均值和标准差，μc+和 σc+分别为阳性对照的平均值和标准差。Z' ≥ 0.5 认为适用于高通量筛选。按照建立的方法对本实验室保存的 100 余个天然产物进行初步筛选，筛选浓度为 10 μg/ml，并对阳性化合物进行评价。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 DNA 目的片段的体外扩增

以叙利亚金黄地鼠基因组 DNA 为模板扩增目的片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得了预期大小的目的片段（图 1A），将其克隆至 pGM-T 载体，扩增并提取纯化质粒后测序，测序结果与 GenBank（AY184211.1）中收录的序列有 100% 同源性。

2.2 pGL4.17-INGAP 报告基因重组质粒的构建

对构建的 pGL4.17-INGAP 进行酶切鉴定，结果表明，INGAP 基因上游调控序列定向插入到 pGL4.17 载体的荧光素酶报告基因上游（图1B），成功构建了重组质粒 pGL4.17-INGAP。

2.3 瞬时转染条件的建立与优化

以转染 pGL4.17-basic 质粒的 HIT-T15 细胞作为阴性对照，检测转染了重组质粒 pGL4.17-INGAP 的细胞荧光素酶活性，结果表明，后者的荧光素酶表达活性明显增高，说明该启动子片段能够促进荧光素酶的表达。同时对质粒浓度和重组质粒与内参质粒比例进行优化，当DNA:Lipofectamine 2000 比例为 1:3（w:V）、pGL4.17-INGAP:pRL-TK 比例为 100:1 时，转染效率最高（图2，n = 3）。

A：M：DNA 分子量标准；1：INGAP 启动子序列PCR 扩增产物 B：M：DNA 分子量标准；1：pGL4.17-INGAP 经Xho I和Bgl II双酶切电泳结果

Figure 1 PCR product of INGAP promoter (A) and restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid pGL4.17-INGAP (B)

2.4 阳性对照的建立及模型评价

2.4.1 溶剂对荧光素酶活性的影响 在化合物筛选过程中，样品一般溶解在 DMSO 中。实验结果表明，当 DMSO 浓度小于 0.1% 时，基本不会对本模型产生明显影响（图 3A），因此，DMSO 的终浓度不能高于0.1%。

2.4.2 阳性化合物浓度对荧光素酶活性的影响 由于目前没有能够特异上调INGAP 的阳性药物的报道，根据文献选择化合物 PMA 作为阳性对照[8]，并对PMA 在该筛选模型上的最佳作用浓度进行探索。结果表明，当 PMA 浓度小于100 ng/ml 时，相对荧光素酶活性值随着 PMA 浓度的增加而升高，呈现浓度依赖性（图 3B），与文献[8]报道一致，说明 PMA 能有效作用于该模型，提示 PMA 对 INGAP 基因表达的上调作用可以通过荧光素酶的表达活性反映出来。

2.4.3 化合物作用时间对荧光素酶活性的影响 转染后 6 h 加入 PMA，分别在加药后 20、24、30、42、72 h 检测荧光素酶的表达活性。结果显示，加药后 30 h，荧光素酶表达活性随着时间延长而升高，超过 30 h 后随着时间延长活性降低，因此选择最佳作用时间为 30 h（图 3C）。

2.4.4 模型评价 以 PMA 为阳性对照，以 Z'因子为指标对模型进行评价，结果表明，本研究建立的模型 Z'因子为 0.57，优于进行高通量筛选试验所要求的大于 0.5 的标准，说明本研究建立的以 INGAP 启动子为靶点的基因表达上调剂筛选模型稳定可靠，适用于进行高通量筛选。

2.5 化合物初步筛选结果

应用该模型对本实验室保存的天然产物进行筛选，上调率 150% 视为阳性，发现白藜芦醇对 INGAP 启动子上调作用明显。用不同浓度的白藜芦醇作用于 pGL4.17-INGAP-HIT 细胞，结果显示，白藜芦醇对启动子的上调作用呈现浓度依赖性，半数有效浓度为 1.6 μg/ml（图 4A）。MTT 比色法检测白藜芦醇对 HIT-T15 细胞增殖活力的影响，发现其对细胞毒性较小，IC50= 34.27 μg/ml（图 4B）。

A：转染试剂浓度对荧光素酶活性的影响（***P < 0.001 vs 对照组）；B：重组质粒与内参质粒比例对荧光素酶活性的影响（**P < 0.05 vs 对照组；***P < 0.001 vs 对照组）

Figure 2 Establishment and optimization of the transient transfection model

A：DMSO 浓度对荧光素酶活性的影响（***P < 0.001 vs 对照组）；B：PMA 浓度对荧光素酶活性的影响（***P < 0.001 vs 对照组）；C：化合物作用时间对荧光素酶活性的影响

Figure 3 The establishment and optimization of the positive control

A：白藜芦醇对pGL4.17-INGAP-HIT 细胞荧光素酶活性的影响；B：白藜芦醇的细胞毒性检测

Figure 4 Related bioactive research of resveratrol

3 讨论

INGAP 是一个由 175 个氨基酸组成的、分子量为 16.8 kD 的分泌蛋白，属于C 型凝集素超家族中的 Reg-III家族，主要在胰腺和小肠表达，在肝脏中也有少量表达[6]。INGAP 启动子序列长约3 kb，包括了 TATA-box、CAAT box、AP-1 等通用转录因子结合位点，还包括胰腺特有的转录因子结合位点，这些转录因子包括 PDX-1、PAN-1、Isl-1、Ngn3、NeuroD 等，在胰腺细胞分化过程中起到重要的指向作用，直接影响 INGAP 启动子的活性[8-9]。我们选择 HIT-T15 细胞作为载体，该细胞虽然高度分化，但仍保留了正常胰岛细胞的很多功能，能够内源性表达 PDX-1、NeuroD 和 PAN-1等相关转录因子[10]，提供了比较真实的 INGAP 在胰腺中表达的天然环境。另外，本研究选取的 INGAP 基因启动子序列，包括了转录起始位点和若干重要的顺式作用调控元件等核心启动子区域，能够较好地反映活性物质在体内的综合作用效果。

构建的模型采用双荧光素酶检测系统作为检测手段，以海肾荧光素酶质粒作为内参，通过内参的校正能够把影响细胞瞬时转染准确性的内在因素的变化降到最小，并且利用该模型进行筛选时，只需关注相对荧光素酶活性的变化，方法简便、快捷、准确、灵敏性高[11]。

利用该研究建立的模型对本研究所化合物库进行筛选，发现白藜芦醇对INGAP 启动子有明显上调作用，EC50= 1.6 μg/ml，具有深入研究的价值。白藜芦醇是天然的多酚类化合物，多存在于葡萄和红酒中，具有抗氧化、抗炎、激活抗衰老酶 sirtuin 等多种药理特性[12]。已有研究表明，白藜芦醇能够促进葡萄糖摄取、提高肝糖耐受量和对胰岛素的敏感性，可能的机制是白藜芦醇激活 SIRT-1，通过影响机体代谢水平来发挥降血糖作用，也可能是通过抑制胰岛 β 细胞 KATP通道或者激活 GLP-1 途径以促进胰岛素分泌[12-15]，但其与 INGAP 的关系尚无报道，那么，白藜芦醇的抗糖尿病作用是否与上调 INGAP 有关，我们将继续进行深入的研究。

综上所述，本研究构建了以 INGAP 启动子为靶点的基因表达上调剂筛选模型，并筛选到了一个具有明显上调作用的化合物白藜芦醇。此模型的建立对探讨基于 INGAP 药物的分子作用机制以及探索开发新型糖尿病治疗药物都具有重要的意义。

[1] Al-Baharna MM, Whitford DL. Clinical audit of diabetes care in the bahrain defence forces hospital. Sultan Qaboos Univ Med J, 2013, 13(4):520-526.

[2] Bell GI, Polonsky KS. Diabetes mellitus and genetically programmed defects in beta-cell function. Nature, 2001, 414(6865):788-791.

[3] Pittenger GL, Taylor-Fishwick D, Vinik AI. The role of islet neogeneis-associated protein (INGAP) in pancreatic islet neogenesis. Curr Protein Pept Sci, 2009, 10(1):37-45.

[4] Lee CS, De León DD, Kaestner KH, et al. Regeneration of pancreatic islets after partial pancreatectomy in mice does not involve the reactivation of neurogenin-3. Diabetes, 2006, 55(2):269-272.

[5] Lipsett M, Hanley S, Castellarin M, et al. The role of islet neogenesis-associated protein (INGAP) in islet neogenesis. Cell Biochem Biophys, 2007, 48(2-3):127-137.

[6] Borelli MI, Del Zotto H, Flores LE, et al. Transcription, expression and tissue binding in vivo of INGAP and INGAP-related peptide in normal hamsters. Regul Pept, 2007, 140(3):192-197.

[7] Dungan KM, Buse JB, Ratner RE. Effects of therapy in type 1 and type 2 diabetes mellitus with a peptide derived from islet neogenesis associated protein (INGAP). Diabetes Metab Res Rev, 2009, 25(6): 558-565.

[8] Taylor-Fishwick DA, Rittman S, Kendall H, et al. Cloning genomic INGAP: a Reg-related family member with distinct transcriptional regulation sites. Biochim Biophys Acta, 2003, 1638(1):83-89.

[9] Taylor-Fishwick DA, Shi W, Pittenger GL, et al. PDX-1 can repress stimulus-induced activation of the INGAP promoter. J Endocrinol, 2006, 188(3):611-621.

[10] Taylor-Fishwick DA, Shi W, Hughes L, et al. Pdx-1 regulation of the INGAP promoter involves sequestration of NeuroD into a non-DNA-binding complex. Pancreas, 2010, 39(1):64-70.

[11] Alcaraz-Pérez F, Mulero V, Cayuela ML. Application of the dual-luciferase reporter assay to the analysis of promoter activity in Zebrafish embryos. BMC Biotechnol, 2008, 8:81.

[12] Yu W, Fu YC, Wang W. Cellular and molecular effects of resveratrol in health and disease. J Cell Biochem, 2012, 113(3):752-759.

[13] Pollack RM, Crandall JP. Resveratrol: therapeutic potential for improving cardiometabolic health. Am J Hypertens, 2013 Sep 11. [Epub ahead of print]

[14] Timmers S, Hesselink MK, Schrauwen P. Therapeutic potential of resveratrol in obesity and type 2 diabetes: new avenues for health benefits? Ann N Y Acad Sci, 2013, 1290:83-89.

[15] Jimenez-Gomez Y, Mattison JA, Pearson KJ, et al. Resveratrol improves adipose insulin signaling and reduces the inflammatory response in adipose tissue of rhesus monkeys on high-fat, high-sugar diet. Cell Metab, 2013, 18(4):533-545.

Establishment and preliminary application of a screening model for identifying up-regulators of INGAP expression

ZHANG Xu-meng, WANG Lin-lin, REN Hao, HE Qi-yang, CHEN Ru-xian, XIE Yun-ying

To establish a screening model for identifying up-regulators of INGAP expression and screen active compounds.

Syrian golden hamster genome was used as template to amplify the core promoter sequence of INGAP. Then the obtained promoter fragment was cloned into pGL4.17 vector to construct the recombinant plasmid which subsequently was co-transfected into HIT-T15 cell line together with the internal reference plasmid pRL-TK using Lipofectamine 2000. The luciferase activity was detected using dual-luciferase reporter assay system in 96-well format. After optimizing the conditions of transient transfection, PMA was used as positive control to assess the validation of the model. The compounds in the library of our institute were then screened.

The recombinant plasmid named pGL4.17-INGAP was constructed and successfully transfected into HIT-T15 cell strain. The model was evaluated by positive control after optimization, and Z' factor is 0.57, showing that the model was able to use for screening up-regulators. Among the screened compounds, resveratrol showed up-regulated activity with EC50value of 1.6 μg/ml.

The cellular screening model for identifying up-regulators of INGAP expression was established.

Transcription initiation site; Drug evaluation, preclinical; Islet neogenesis associated protein

XIE Yun-ying, Email: xieyy@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.003

国家自然科学基金面上项目（81072556）；十二五“重大新药创制”国家科技重大专项（2012ZX09301-002-001-018）

解云英，Email：xieyy@imb.pumc.edu.cn

2013-12-03

Author Affiliation: Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China