李 娜 曲晓波 李 晶 律广富 杨 擎 常志达 张婧卓 王晓琴 王贺彬 林 喆

(长春中医药大学研发中心药理实验室，吉林 长春 130117)

鹿角胶为鹿科动物梅花鹿或马鹿的角煎熬而成的胶块，《本草汇言》记载“鹿角胶，壮元阳，补血气，生精髓，暖筋骨”，具有温补肝肾、强筋壮骨、活血消肿的作用，可治疗腰脊冷痛、阴疽疮疡、乳痈突起和癖血肿痛等症〔1，2〕。骨质疏松(OP)是一种以骨密度下降和骨微结构破坏为特征，造成骨强度下降，骨脆性增加和易发生骨折的代谢性骨病〔3〕。现代药理研究表明鹿角胶具有抗OP的作用〔4〕，为了进一步探讨鹿角胶对OP的治疗作用。本文从细胞水平研究鹿角多肽(AP)对成骨细胞MG63氧化应激造成的影响，初步探讨其对成骨的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1细胞株、主要试剂及仪器 人成骨肉瘤细胞株MG63由省肿瘤医院中心实验室提供，胎牛血清、1640培养基和胰蛋白酶均购于GibcoBRL 公司。梅花鹿角(购于吉林省长春市双阳区鹿乡镇)，按照传统方法制备得到鹿角胶，提取率为29.3%，取熬制的鹿角胶加入柠檬酸和胃蛋白酶，37℃下酶解，上清液进行盐析，然后透析(透析袋为2000)，冻干得AP，提取率为4.86%。兔抗人骨形态发生蛋白(BMP-2)抗体、羊抗兔二抗购于Pe-protech公司，二氯基联基胺(DAB)KIT显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)均购自于南京建成生物工程研究所。CO2培养箱购自Thermo公司，550型酶标仪购自美国BIO-RAD 公司，Leica石蜡切片机，Leica摊片机，Leica包埋机均为德国Leica 公司产品。倒置荧光显微镜(IX-8)购自日本Olympus公司。

1.2MG63细胞培养 将MG63细胞置于含有10%胎牛血清和青链霉素各100 U/Ml培养基，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内常规培养，待细胞长致80%融合时进行后续实验。

1.3分组及给药 取对数生长期的MG63细胞随机分成空白组：连续用培养液培养；H2O2损伤模型组：先用正常培养液培养48 h，再加入H2O2(浓度为0.5 mmol/L)，培养4 h；AP组：AP(0.1、0.15、0.1、0.05和0.01 mg/ml)培养48 h后，再加入H2O2损伤4 h(浓度为0.5 mmol/L)后进行检测。

1.4四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞活力 将细胞接种于96孔板，每孔5×104个/ml的细胞悬浮液100 μl、培养12 h完全贴壁，按1.3分组，模型组先用培养基培养48 h，给药组用AP处理48 h后，模型组和AP组用H2O2(0.5 mmol/L，4 h)处理，每孔20 μl加入MTT，4 h后甩板，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)使其显色，显色后振动孵育10 min，使结晶溶解完全，酶标仪490 nm测吸光度值(OD值)。

1.5HE染色 将细胞用胰酶消化后，调整细胞浓度约1×105/ml，接种于6孔板(内置无菌盖玻片)内。待细胞融合达到70%时，按照1.3分组及给药，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，甲醇固定30 min，PBS洗涤2次，加入Von Kossa 液染色30 min，中性树胶封片后显微镜下观察拍照。

1.6免疫组织化学法检测细胞中BMP-2的蛋白水平 细胞爬片方法同1.5，去除固定液，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX100 作用20 min，加入BMP-2 抗体(1∶50稀释)，室温作用1 h，二抗用PBS稀释200倍，辣根酶标记。DAB显色，HE复染。于荧光倒置显微镜观察。

1.7检测细胞上清液中SOD、MDA、LDH含量 按照1.3方法将细胞接种于6孔板，弃上清，用PBS冲洗3次，加入0.2 ml 裂解液，用刮刀将细胞刮下，移至EP管中，13 000 r/min离心30 min，收集上清按试剂盒要求，检测细胞上清液中SOD、MDA、LDH的含量。

2 结 果

2.1AP对氧化损伤MG63细胞活力的影响 与空白组(1.04±0.01)比较，模型组(0.81±0.03)细胞活力明显降低(P<0.01)；与模型组比较，AP给药组的细胞生存率明显升高，最佳给药浓度为0.05 mg/ml(0.97±0.05)(P<0.01)。其中0.1 mg/ml组OD值为(0.92± 0.05),0.15 mg/ml组OD值(0.91±0.04)；0.01 mg/ml组OD值(0.93±0.03)。

2.2AP对氧化损伤MG63细胞HE染色结果 空白组细胞核细胞质染色对比分明，细胞核多为类圆形，H2O2损伤模型组细胞部分皱缩，细胞核暗淡，伪足消失；AP(0.05 mg/ml)组细胞损伤程度减轻，细胞核折光性较模型组好，伪足略变细。见图1。

2.3BMP-2蛋白免疫组织化学染色的结果 免疫组织化学染色显示，BMP-2在MG63细胞质中呈褐色表达，与模型组比较，空白组和AP组细胞胞浆内分布着棕黄色颗粒，呈明显阳性。见图2。

空白组 模型组 AP组

空白组 模型组 AP组

2.4氧化损伤MG63细胞SOD、MDA、LDH的活性测定 模型组与空白组比较均具有统计学意义(P<0.01)，H2O2可使MDA的含量明显增高，SOD活性降低；AP组与模型组比较，AP可抑制MDA的活性(P<0.05)，并减轻LDH从MG63细胞中的漏出量(P<0.01)，并可显著升高SOD含量(P<0.01)。见表1。

表1 AP对H2O2氧化损伤MG63分泌SOD、MDA、LDH的影响

3 讨 论

OP主要是由于破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成动态平衡被打破，其中氧化应激是导致成骨细胞形成减少、功能减退的主要因素之一〔5〕。人成骨肉瘤MG63细胞株具有成骨细胞的大部分特征，被广泛应用于OP的基础研究。鹿角胶具有壮元阳，补血气，生精髓，暖筋骨的功效，在前期研究中发现鹿角胶具有抗OP和抗衰老的作用〔4〕。

BMP-2为一分子量20 000左右的酸性多肽，是具有特殊生物学活性的细胞生长因子，是目前已知的对骨形成作用较强的生长因子之一。BMP-2能诱导未分化的间充质细胞经过趋化期、分化期、骨质形成及重塑期4个环节不可逆分化为软骨细胞和成骨细胞〔6，7〕，并协同其他调节因子参与骨形成，是骨修复过程中不可缺少的骨诱导蛋白。H2O2能够引起成骨细胞的氧化损伤，减少成骨细胞的数量，提高破骨细胞的活性，直接参与骨基质的降解，可以认为氧化损伤参与和加速了OP的病理过程。同时引发脂质过氧化作用，其结果是自由基攻击生物膜中不饱和脂肪酸，裂解生成脂质过氧化终产物MDA，因此，测定MDA能较好地反映脂质过氧化水平，间接地反映出细胞损伤的程度〔8〕。SOD是体内氧自由基的清除剂之一，通过催化消除超氧阴离子自由基阻碍氧自由基的产生，保护细胞的正常功能，它是一种广泛存在于生物体内与细胞氧代谢密切相关的酶，因此测定SOD的活力可间接反映体内自由基的产生和毒物对细胞的损伤情况，亦可反映组织内清除自由基的能力〔9，10〕。LDH属于氧化还原类酶，主要分布于细胞的胞质液中,是生物体细胞内参与糖代谢过程的一种重要酶，参与机体的能量代谢，LDH量的改变,直接影响到机体的能量代谢，反映了细胞的活力。

本研究结果显示，AP能够促进氧化损伤成骨细胞MG63的增殖，使细胞胞浆饱满，细胞核大呈圆形，核仁清晰,并能促进细胞中BMP-2蛋白的表达，保护氧化损伤的成骨细胞。同时提示AP能改善氧化应激产物的数量，降低脂质过氧化物含量，增强细胞内SOD的活性，保护氧化损伤的成骨细胞，调节BMP-2表达促进骨形成。

4 参考文献

1曹春林.鹿角胶药制法及其质量探讨〔J〕.中成药，1980；1：7.

2庄兰英.胶类药材的氨基酸分析及鹿茸皮的利用试探〔J〕.中成药，1982；5：27.

3Consensus development conference.Diagnosis，prophylaxis，and treatment of osteoporosis〔J〕.Am J Med，1993；94(6)：646-50.

4蒙海燕,曲晓波,李 娜,等.鹿茸及鹿角胶对去卵巢大鼠骨质疏松的影响〔J〕.中药材,2009；32(2):179-81.

5Xu ZS,Wang XY,Xiao DM,etal..Hydrogen sulfide protects MC3T3-E1 osteoblastic cells against H2O2-induced oxidative damage-implications for the treatment of osteoporsis 〔J〕.Free Radic Biol Med,2011；50(10):1314-23.

6Tsuchida H，Hashimoto J，Crawford E，etal.Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats 〔J〕 .J Orthop Res，2003；21(1)：44-53.

7赵 春,张艳红,谢焕松,等.杜仲对去势大鼠骨细胞及骨髓间充质干细胞BMP-2表达的调节作用〔J〕.四川中医,2009；27(8):24-7.

8Gawel S,Wardas M,Niedworok E,etal.Malondialdehyde(MDA) as a lipid peroxidation marker〔J〕.Wiad Lek，2004；57(9-10):453-5.

9刘 雷,郭元晖,辛海量,等.仙茅苯甲酸酯类酚苷对去卵巢骨质疏松大鼠的作用〔J〕.中西医结合学报,2012；10(12):1419-26.

10杨希重,季翠杰,王德春,等.去卵巢骨质疏松模型大鼠的番茄红素干预〔J〕.中国组织工程研究,2012；16(15):2750-66.