中正

1.吉首大学医学院，湖南 吉首 416000;2.吉首大学数学与统计学院2012级统计学研究生,湖南 吉首 416000

苗医推拿对缓解期哮喘儿童IFN-γ、IL-4、IL-17的影响及表观遗传学机制

石维坤1李艳2李中正1

1.吉首大学医学院，湖南 吉首 416000;2.吉首大学数学与统计学院2012级统计学研究生,湖南 吉首 416000

目的观察苗医推拿治疗缓解期儿童哮喘的临床疗效及对免疫平衡的影响，并初步探讨其表观遗传学机制。方法30例健康儿童为健康对照组。30例哮喘缓解期儿童为推拿组，比较推拿前后儿童哮喘控制测试(C-ACT)评分，检测血清Th1、Th2及Th17的代表性细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的含量及外周血CD4+T细胞的组蛋白乙酰转移酶(HAT)及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的活性。结果苗医推拿总有效率达93.34%，可升高血清IFN-γ水平，同时降低IL-4及IL-17水平，并抑制HAT活性，同时增强HDAC活性(均P<0.05)。结论苗医推拿治疗缓解期儿童哮喘疗效肯定，能有效调节免疫平衡。组蛋白乙酰化修饰等表观遗传学机制可能在其中发挥了一定作用。

湘西刘氏小儿推拿；哮喘；IFN-γ；IL-4；IL-17；表观遗传学

儿童支气管哮喘是目前临床常见的慢性呼吸道疾病，有反复发作、缠绵难愈的特点[1]。经典理论认为Th1型免疫反应减弱而Th2型免疫反应异常增强在哮喘的发病过程中起到重要作用，即Th1/Th2细胞失衡学说[2-3]；近年来发现Th17细胞/Treg(调节性T细胞)的免疫失衡也是哮喘发病的重要机制之一[4]。我国已故著名推拿大师刘开运教授开创了独具特色的苗医“小儿推拿”[5]，称为湘西刘氏小儿推拿流派，治疗小儿肺、脾系疾病疗效最为显著[6]。本研究对比治疗前后血清Th1、Th2及Th17的代表性细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的含量，观察苗医推拿对缓解期哮喘儿童免疫平衡的影响；并通过检测外周血CD4+T细胞的组蛋白乙酰转移酶(HAT)及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的活性，初步探讨其表观遗传学机制。本研究得到了吉首大学医学伦理委员会的审查和批准(批准号：20130002)。

1 材料与方法

1.1 病例资料 收集吉首大学附属中医院(湘西土家族苗族自治州民族中医院)门诊病例30例，作为推拿组，其中男13例，女17例；土家族20例，苗族10例；年龄最小5岁，最大6岁半，平均6.45±1.18岁；病程最短6个月，最长4年，平均3.32±1.56年。纳入标准：①年龄5至7岁，性别不限，民族不限；②符合缓解期儿童哮喘诊断标准[7]；③除哮喘外无其他疾病；④患儿家长或监护人签署知情同意书。另从健康管理中心随机收集30例健康儿童为健康对照组，要求年龄5至7岁，无过敏病史，近期无呼吸道感染史，近期未使用药物；其中男11例，女19例；土家族18例，苗族12例；年龄最小5岁，最大7岁，平均6.74±1.48岁。2组儿童在性别、民族构成、年龄等方面差异均无显著性(P>0.05)。

1.2 治疗方法 推拿组治法为：补益脾肺、固肾纳气。患儿面向医生站立，取其左侧肢体施术，用姜汁作推拿介质，具体推治如下：常例手法(开天门、推坎宫、推太阳、按总筋、分阴阳各30次)。补肾经400次，补肺经350次，补脾经300次，清肝经250次，揉外劳宫100次，揉板门120次，揉按肺俞150次，捏脊5遍，推膻中120次，揉中脘、丹田各150次，揉按足三里120次，按肩井3次。

女童由女医师进行推拿治疗。每周治疗3次(具体时间由儿童的监护人决定)，共治疗3个月。治疗前后分别采集哮喘患儿晨起空腹静脉血10ml。健康对照组儿童入组后也采集晨起空腹静脉血10ml。

1.3 观察指标

1.3.1 儿童哮喘控制测试(C-ACT)[8]治疗前后各评估一次。得分≥25分为哮喘临床控制，20～24分为部分控制，<20分为未控制。

1.3.2 细胞因子含量检测 IFN-γ、IL-4、IL-17试剂盒购自武汉博士德公司，酶标仪(美国Bio-Tek，ELX-800)，采用ELISA法检测血清细胞因子的含量，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.3.3 HAT、HDAC活性检测 淋巴细胞分离液购自上海研谨公司，分选MACS微珠(CD4)购自德国Miltenyi公司，HAT、HDAC活性试剂盒购自美国Biovision公司。对采集的静脉血采用密度梯度离心法(Ficoll法)分离外周血单个核细胞，免疫磁珠进一步分离CD4+T细胞，ELISA法检测吸光度。用试剂盒中一系列已知浓度的标准品绘制蛋白浓度标准曲线，计算去乙酰化赖氨酸的浓度，来代表HAT、HDAC的活性。严格按试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 推拿组临床疗效 临床控制11例(36.67%)，部分控制17例(56.67%)，未控制2例(6.67%)，总有效率28例(93.34%)。

2.2 苗医推拿前后血清细胞因子对比

表1 苗医推拿前后血清IFN-γ、IL-4、IL-17对比

注：与健康对照组比较，△P<0.05；与推拿治疗前比较，#P<0.05

表1结果提示：缓解期哮喘患儿血清IFN-γ、IL-4及IL-17显著高于健康儿童(P<0.05)；苗医推拿治疗后与治疗前比较，血清IFN-γ显著升高，IL-4及IL-17显著降低(均P<0.05)，与健康对照组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

2.3 苗医推拿前后外周血CD4+T细胞HAT、HDAC活性对比

表2 苗医推拿前后外周血CD4+T细胞HAT、HDAC活性对比

注：与健康对照组比较，△P<0.05；与推拿治疗前比较，#P<0.05。

表2结果是示：与健康对照组比较，缓解期哮喘患儿外周血CD4+T细胞HAT活性增强，HDAC活性减弱(均P<0.05)；苗医推拿治疗后与治疗前比较，HAT活性降低，HDAC活性增强(均P<0.05)，与健康对照组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

3 讨论

湘西刘氏小儿推拿流派是国内著名的小儿推拿流派之一[6]，推拿名家严隽陶教授就推拿学源流特别指出“鲁东湘西的儿科推拿”各具特色[9]。哮喘患儿缓解期主要表现为肺脾肾三脏的虚损，苗医推拿治疗缓解期哮喘以调治脏腑、增强体质、预防复发为目的，体现了中医“未病先防、既病防变”的治未病理念。推治过程中开天门、推坎宫、推太阳、按总筋、分阴阳各30次为本流派常例“开窍”手法；推治五经根据五行生克、助制[10]之理，采用“补三抑一法”，即主补肾经，兼补肺经、次补脾经、稍清肝经，重在补肾、肺、脾三经治其本，断其伏痰，清肝经以防肝旺乘脾侮肺；肺俞、膻中宽胸理气，宣肺化痰；揉中脘、板门、足三里，捏脊健脾化湿；揉丹田、外劳宫温补阳气；按肩井“关窍”。从临床实践来看，苗医推拿能有效控制哮喘，预防复发(总有效率达93.34%)。

IL-4与哮喘气道重塑的发生存在内在关联性；IFN-γ有利于Th1细胞的分化，而抑制Th2的分化，达到Th1/Th2的平衡状态，从而使哮喘患者的气道炎症得到控制[11]；IL-17在哮喘的炎症中发挥重要作用，表达水平与哮喘发作程度呈正相关[12]。本研究印证了缓解期哮喘儿童Th1/Th2平衡紊乱、Th1及Th17应答增强，并证实了苗医推拿能够调节Th1/Th2平衡，下调IL-17含量(均P<0.05)。

表观遗传学的改变在哮喘的发病机制中起着重要作用[13]。表观遗传学研究不涉及DNA序列改变的基因表达调控，主要包括组蛋白修饰、DNA甲基化与非编码调节性RNA调控。组蛋白修饰包括乙酰化、甲基化和磷酸化等，其中乙酰化及去乙酰化修饰研究较多，是动态的可逆的修饰。HAT促进组蛋白乙酰化和相关基因的转录，而HDAC促进组蛋白去乙酰化，抑制相关基因转录。哮喘患者支气管肺泡灌洗液巨噬细胞及活检肺组织标本中HAT活性增强伴随HDAC活性降低[14]，外周血单个核细胞也存在同样的改变[15]。本研究结果显示，苗医推拿治疗3个月后，患儿外周血CD4+T细胞HAT活性显著降低而HDAC活性显著升高(均P<0.05)，说明苗医推拿可抑制HAT活性，增强HDAC活性，减弱组蛋白乙酰化，这可能是其调节哮喘患儿免疫平衡的表观遗传学机制之一，但能否长期保持这种表观遗传学状态，还需要进一步研究。

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湖南省中医药管理局科研课题(项目编号：2013104)。

李中正(1985- )，男，土家族，湖南慈利人，硕士，讲师，执业中医师，主要从事推拿学的教学科研工作。

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1007-8517(2014)07-0011-02

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