程 雪，査安生

(1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽省中医院消化内科，安徽 合肥 230031)

·实验研究·

益气解毒化瘀方对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-23和IL-10的影响

程 雪1，査安生2

(1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽省中医院消化内科，安徽 合肥 230031)

目的观察益气解毒化瘀方对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)大鼠血清白细胞介素-23(interleukin-23, IL-23)和白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)水平的影响，探讨益气解毒化瘀方治疗UC的机制。方法将50只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶(salicylazosulfapyridine, SASP)组、益气解毒化瘀方低剂量组和益气解毒化瘀方高剂量组，每组10只大鼠。采用三硝基苯磺酸联合无水乙醇灌肠法复制UC模型。药物干预4周后，肉眼下观察各组大鼠结肠大体病理损伤指数(chief morphology damage index, CMDI)，光镜下观察各组大鼠结肠组织损伤指数(tissue damage index, TDI)，采用酶联免疫吸附试验检测大鼠血清IL-23和IL-10水平。结果各治疗组大鼠结肠CMDI和TDI评分及血清IL-23水平较模型组显著降低(P<0.01)，血清IL-10水平较模型组显著升高(P<0.01)；益气解毒化瘀方高剂量组在改善上述指标方面显著优于益气化瘀解毒方低剂量组和SASP组(P<0.05，或P<0.01)。结论益气解毒化瘀方通过调节促炎性细胞因子和抑炎性细胞因子平衡，达到治疗UC目的。

溃疡性结肠炎；白细胞介素-23；白细胞介素-10；组织形态学；益气解毒化瘀方

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种肠道慢性非特异性炎症性疾病，病变主要累及黏膜和黏膜下层，以腹泻、腹痛、黏液脓血便等为主要表现。该病治疗难度大，疗程长，而且治愈后常易复发，已成为临床常见的难治性疾病。UC的病因及发病机制尚未完全明确，目前认为UC的发病主要涉及免疫调节紊乱、遗传易感性、感染、环境及肠黏膜屏障受损等因素。目前大多数学者认为促炎性细胞因子与抗炎性细胞因子之间平衡失调所致免疫异常是UC的重要发病机制。目前西医对于UC尚无满意的治疗手段，而中医药具有毒性和不良反应小、远期疗效好等优势。本实验采用2,4,6-三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS)联合无水乙醇复制UC大鼠模型，观察中药益气解毒化瘀方对UC大鼠血清白细胞介素-23(interleukin-23,IL-23)和白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)水平的影响，探讨其治疗UC的作用机制，为其进一步的临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级健康成年SD大鼠50只，雄性，体质量180～200 g，购于安徽长临河生物科技有限公司。实验动物生产许可证：SCXK(皖)2012-014。

1.2 药物 益气解毒化瘀方中所有药物均由安徽省中医院中药房提供，药物组成：薏苡仁30 g，马齿苋、地锦草、炒谷芽各15 g，党参、炒白术、赤芍、白芍、煨木香、白及、黄柏各10 g，三七粉5 g，黄连2 g。按组方比例称取药材，常规方法制备水煎液，每毫升含生药1.5 g。西药柳氮磺吡啶片(salicylazosulfapyridine, SASP)购于安徽中医药大学第一附属医院西药房，由上海三维制药有限公司生产，每片0.25 g 。使用时将SASP去除包衣，研碎后过100目筛，用蒸馏水配成40 mg/ml混悬液，置4 ℃冰箱保存备用。

1.3 试剂 5% TNBS：Sigma公司，批号 P2297；无水乙醇：上海彤晟化工科技有限公司，产品批号 100601；IL-23检测试剂盒(批号 SX201310348)、IL-17检测试剂盒(批号 SX201310256)、IL-10检测试剂盒(批号 SX201309251)：上海森雄生物科技有限公司。

1.4 实验仪器 RT-6000型酶标仪：雷杜公司；JW3021HR型离心机：安徽嘉文公司；DNP-9052BS-Ⅲ型电热恒温箱：上海三发公司；BM-Ⅱ型病理组织包埋机：安徽省电子科学研究所；RM2135型石蜡切片机：Leica公司；Nikon80型荧光显微镜：新飞达光学仪器。

2 方法

2.1 动物分组 将50只大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、SASP组、益气解毒化瘀方低剂量组(简称中药低剂量组)、益气解毒化瘀方药高剂量组(简称中药高剂量组)，每组10只。在22～28 ℃下饲养，相对湿度50%～60%，自然光照周期，以普通饲料喂养，自由饮水。

2.2 模型复制 采用TNBS联合无水乙醇灌肠法复制UC大鼠模型[1]。将大鼠正常饲养10 d后，于第11天禁食(不禁水)24 h，称质量，除正常组外，其他各组SD大鼠用10%水合氯醛(3.0 ml/kg)腹腔注射麻醉，予TNBS 100 mg/kg加50%无水乙醇0.25 ml，用直径约1.5 mm聚丙烯管插入肛门上端约8 cm后，一次性注入上述混合试剂，捏紧肛门，提尾倒立3 min后，放回笼中自然苏醒。模型复制后第2天，大鼠出现腹泻、血便、懒动等情况。随机抽取2只模型大鼠处死，取肠组织，清洗后肉眼观察结肠充血水肿情况，可见肠壁充血、水肿，内壁纹理模糊；并取8 cm肠段用甲醛固定，病理切片可观察到大量炎性细胞浸润、黏膜损伤等病理改变，即可证实UC大鼠模型复制成功。

2.3 给药 模型复制后将各组大鼠置于同等条件下喂养，模型复制后第13天，各组开始给药，每组大鼠的灌胃容积均为25 ml/kg。SASP组给予SASP 0.4 g/kg(相当于成人剂量7倍)，每日给药1次，共4周。给药量根据体质量而定，且所有实验大鼠每日称体质量1次，以便随时调整给药量。益气化瘀解毒方高、低剂量组分别按30、15 g/kg灌胃(分别相当于临床成人临床用量的14、7倍)，每日给药1次，共4周。正常组及模型组大鼠均予等容积生理盐水灌胃，每日1次，共4周。灌胃期间观察大鼠的精神活动状态、饮食状况、粪便性质、体质量的改变。

2.4 血标本采集 末次灌胃给药后，大鼠禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛(3.0 ml/kg)腹腔注射麻醉后剖腹，仰卧固定于手术台上，取正中偏左切口，向右、向上至肋弓下向左剪开，向左翻开腹壁、肠及其附属物，完全暴露腹主动脉，负压管采集血液，室温静置，待自然凝固收缩后，以3 500 r/min离心15 min，分离血清，置于-80 ℃冰箱冷冻保存，用以测定IL-23和IL-10水平。

2.5 结肠标本采集 取全段结肠，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冷生理盐水冲洗肠内容物，肉眼观察结肠黏膜有无充血水肿、溃疡和结肠管壁的变化。留取各组大鼠结肠病变最明显处组织若干，10%甲醛浸泡，以备复制病理切片。

2.6 标本检测

2.6.1 血清IL-23和IL-10测定：按试剂盒说明书采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附试验法测定大鼠血清IL-23和IL-10的水平。

2.6.2 结肠大体病理损伤指数(chief morphology damage index，CMDI)观察：取全段结肠，剪开，用生理盐水洗净，平铺于白板上，肉眼观察肠黏膜病变，记录溃疡个数，测量溃疡面积，并根据结肠黏膜的色泽、溃疡、糜烂、出血点、充血等情况进行CMDI评分[2]。最高分8分，包括黏连、溃疡形成及炎症。①黏连：无黏连，0分；轻度黏连(结肠与其他组织剥离较易)，1分；重度黏连，2分。②溃疡形成及炎症：无损伤，0分；局部充血，无溃疡，1分；1处溃疡不伴明显炎症(充血和肠壁增厚)，2分；1处溃疡伴炎症，3分；≥2处溃疡伴炎症，4分；多处损伤(包括溃疡和炎症)，长度>1 cm，5分；多处损伤(包括溃疡和炎症)，长度>2 cm，6分。

2.6.3 结肠组织损伤指数(tissue damage index, TDI)观察：①病变深度：无，0分；黏膜层，1分；黏膜下层，2分；肌层，3分；浆膜层，4分。②炎症程度：无，0分；轻度，1分；中度，2分；重度，3分。③病变范围：无，0分；0～25%，1分；>25%且≤50%，2分；>50%且≤75%，3分；>75%，4分。

3 结果

3.1 大鼠一般状况观察 正常组大鼠反应灵敏，活动及纳食正常，毛发光润，粪便呈颗粒状，体质量较实验前明显增加。模型组大鼠在模型复制后第2天即出现稀便或半稀便，部分大鼠出现肉眼血便，毛色失去光泽，活动及进食明显减少，反应迟钝，体质量下降，嗜卧，扎堆，拱背。中药高剂量组和SASP组大鼠在治疗2周后精神逐渐恢复正常，毛发逐渐恢复光泽，食欲增强，活动逐渐增多，大便逐渐成形。中药低剂量组大鼠在用药后精神也渐渐恢复，毛色渐有光泽，大便也逐渐成形，但恢复程度不及中药高剂量组，进程相对缓慢。

3.2 各组大鼠结肠CMDI和TDI比较 与正常组比较，模型组CMDI和TDI评分显著升高(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组CMDI和TDI评分均显著降低(P<0.01)；中药高剂量CMDI和TDI评分显著低于中药低剂量组和SASP组(P<0.05，或P<0.01)。见表1。各组大鼠结肠组织病理变化见图1。

注：A．正常组；B．模型组；C．SASP组；D．益气活血解毒方低剂量组；E．益气活血解毒方高剂量组。

图1各组大鼠结肠组织形态学变化

(苏木精-伊红染色，10×20倍)

表1 各组大鼠CMDI评分比较

注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与SASP组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与中药低剂量组比较，◇◇P<0.01。

3.3 各组大鼠血清IL-23和IL-10水平比较 与正常组比较，模型组大鼠血清IL-10水平显著降低(P<0.01)，IL-23水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组IL-10水平显著升高(P<0.01)，IL-23水平显著下降(P<0.01)；中药高剂量组IL-10水平显著高于SASP组和中药低剂量组(P<0.01)，IL-23水平显著低于SASP组和中药低剂量组(P<0.05，或P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血清IL-23和IL-10水平比较

注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与SASP组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与中药低剂量组比较，◇◇P<0.01。

4 结论

UC主要侵及肠道黏膜和黏膜下层，病变多数累及直肠和乙状结肠，可伴有不同程度的全身症状和肠外表现[4]。本病可发生在任何年龄，多见于20～40岁，亦可见于儿童或老年，男女发病率无明显差别。由于UC病情轻重不一，病程迁延不愈，治愈后常反复发作，预后较差，具有一定的癌变率，已成为临床常见的难治性疾病。UC治疗手段有限，西医常采用氨基水杨酸类药物(如SASP、奥沙拉嗪、巴柳氮)、糖皮质激素类药物、免疫抑制剂和生物制剂等治疗UC，甚至采用外科手术切除病变，虽取得一定效果，但疗效均不理想，且复发率高、不良反应大。

UC病机复杂，其发病与多种因素相关。近年来许多研究证实，UC的发病可能是在遗传、感染、环境等因素的影响下出现肠道免疫和非免疫系统功能失调，导致炎性细胞和炎性递质异常，使肠道黏膜对抗原呈高敏状态，免疫调节功能紊乱，最终导致肠黏膜慢性炎症和组织损伤，而肠道免疫反应的调节有赖于免疫细胞及免疫球蛋白的参与。越来越多的学者认为，免疫功能紊乱可能是UC发病的中心环节。细胞因子作为细胞间信号传导分子，与靶细胞膜上特异性受体结合，在机体的免疫应答和炎性反应过程中起重要作用。其中促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子在介导和调节免疫应答和UC炎性反应过程中发挥着重要作用[5]。

IL-23是IL-12分子家族中促炎性细胞因子，主要是由激活的单核-巨噬细胞和树突状细胞分泌，由IL-12 p40和IL-23 p19亚单位组成。IL-23具有十分复杂的生物学功能，参与集体控制感染和自身免疫性疾病发生。IL-23还可以诱导初始CD4+T细胞分化为具有致病性Th17细胞，并生成IL-17、IL-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)，引起结肠炎症的发生。

IL-10又名细胞因子合成抑制因子，是典型的抗炎与免疫抑制性细胞因子，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，其主要的生物学作用是抑制活化的单核细胞和巨噬细胞转录分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎性细胞因子，在调节肠道细胞平衡上起重要作用。

UC属于中医学“痢疾”“久痢”“肠风”“脏毒”“肠癖”“腹满”“下利”等疾病范畴。病位在脾胃、大肠，湿热与瘀血为本病的根本病机。UC治疗上多以补益脾胃、清热化湿、活血化瘀为原则。益气解毒化瘀方中，以党参、白术为君，补脾益气、燥湿利水；赤芍、白芍伍用，白芍敛阴，赤芍凉血，退血分之热；马齿苋、地锦草合用，清热解毒、凉血止痢；三七、白及功专活血行瘀、敛疮生肌；薏苡仁、炒谷芽健脾消积利水；黄连配黄柏燥湿清热、凉血解毒而止大便脓血；木香配黄连，行肠胃滞气而除里急后重。前期研究已证实，采用清热解毒、活血化瘀疗法联合SASP治疗UC，可明显缩短腹泻、黏液脓血便及腹痛的时间，明显降低证候积分，显著提高综合疗效、结肠黏膜病变的疗效[6]。

本研究结果表明，益气解毒化瘀方可能是通过下调促炎性细胞因子IL-23，上调抗炎性细胞因子IL-10，从而调控失衡的细胞因子，减少炎性递质的释放，来有效减轻炎性损伤，以促进肠黏膜修复与溃疡愈合，达到治疗UC的目的。这些可能是益气解毒化瘀方药治疗UC的作用机制之一。

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EffectsofQi-tonifying,Detoxicating,andStasis-resolvingPrescriptiononSerumInterleukin-23andInterleukin-10LevelsinRatswithUlcerativeColitis

CHENGXue1,ZHAAn-sheng2

(1.GraduateDivisionofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.DepartmentofGastroenterology,AnhuiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China)

ObjectiveTo observe the effects of qi-tonifying, detoxicating, and stasis-resolving prescription (QDSP) on serum interleukin-23 (IL-23) and interleukin-10 (IL-10) levels in rats with ulcerative colitis (UC) and to investigate the action mechanism of QDSP in the treatment of UC.MethodsFifty male Sprague-Dawley rats were randomly and equally divided into normal group, model group, salicylazosulfapyridine (SASP) group, and low- and high-dose QDSP groups. All rats except those in normal group were treated with an enema containing trinitrobenzenesulfonic acid and anhydrous ethanol to induce a UC model. The SASP group and QDSP groups

respective treatments for 4 weeks. The colon macroscopic damage index (CMDI) was determined by visual inspection, and the tissue damage index (TDI) was determined under a light microscope. Serum IL-23 and IL-10 levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsAll treatment groups showed significant decreases in CMDI and TDI scores and serum IL-23 level (P<0.01) and a significant increase in serum IL-10 level (P<0.01), as compared with the model group. The high-dose QDSP group showed significantly more improvements in the above indices than the low-dose QDSP group and SASP group (P<0.05 orP<0.01).ConclusionQDSP can balance the proinflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines in the treatment of UC.

ulcerative colitis; interleukin-23; interleukin-10; histomorphology; qi-tonifying, detoxicating, and stasis-resolving prescription

程雪(1988-)，女，硕士研究生

查安生，zhaansheng2006@163.com

R574；R285.5

A

10.3969/j.issn.2095-7246.2014.04.023

2014-01-29)