芦春斌，戚青林，周 文，蔡 娟，刘 标

(1.暨南大学生殖免疫研究所，广东广州510632;2.环境保护部南京环境科学研究所，江苏南京210042)

中国是大豆的原产国，同时也是世界上最大的大豆进口国，而进口的大豆中80%以上是转基因大豆［1］。转基因大豆已成为我国大豆市场供应和消费的主体，转基因大豆产品越来越多地进入食品生产与消费链。转基因植物及其加工食品与人们的生活关系日益紧密，对其进行安全性的评估显得尤为重要。目前对抗草甘膦转基因大豆食用安全评估主要集中在组织病理学、脏器系数、血液学、生化分析等，大部分研究报道均表明转基因大豆对实验动物是安全的［2］。Laura［3］等以抗鳞翅类和甲虫类昆虫的转基因玉米谷粒对大鼠进行亚慢性喂食，评价对大鼠摄食量、体重增长、临床观察、眼科、神经行为学、临床病理学和解剖病理学的影响，其结果显示均无显著性影响。He［4］等以富含赖氨酸的转基因玉米对大鼠进行90d亚慢性毒理研究，研究证明该转基因玉米喂食对大鼠体重、食物吸收和利用率、血液学、血清化学、组织病理学等均无显著性影响。雄性生殖器官睾丸、附睾等是一种很敏感的靶标器官，无论对外界化学相关污染还是生物因素都极敏感，它们对睾丸附睾的伤害作用往往早于对其他器官的伤害，在毒理学评估中意义很重要。虽然国内外对抗草甘膦转基因大豆在动物胚胎发育和生殖功能方面的研究已有一些报道，但是转基因大豆饲料对雄性啮齿类动物的雄性生殖器官发育和功能，尤其是对早期精细胞、附睾精子顶体形态结构和功能的影响的研究极少。本实验对30d短期和90d长期喂食抗草甘膦转基因大豆的小鼠进行了生殖细胞发育、精子顶体形态结构和功能的生殖毒理研究，为评估抗草甘膦转基因大豆的生物安全性提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

断乳的昆明小鼠(SPF级)由暨南大学医学院动物中心提供;吉姆萨染液、孕酮、络合异硫氰酸荧光素的豌豆凝集素(FITC－PSA)、二甲基亚砜 Sigma;注射用环磷酰胺 江苏恒瑞医药股份有限公司;其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ECLIPSE TE200型光学显微镜 日本尼康公司;MCO－175型CO2培养箱 日本三洋公司;Centrifuge 5415型微型高速离心机 德国Eppendof公司;E400型荧光显微镜 日本尼康公司。

1.3 实验动物分组及处理

将216只离乳后的昆明品系雄性小鼠在实验室以非转基因大豆饲料适应性饲养一周后，再随机分为3组，每组72只;第1组喂食转基因大豆豆粕加工的饲料作为实验组(GM组)，第2、3组喂食非转基因大豆豆粕加工的饲料作为对照组，其中2组除喂食非转基因大豆饲料外不做其他处理作为阴性对照组(CK组)，此外第3组小鼠在每次实验取样前两周小鼠腹腔注射环磷酰胺作为阳性对照组(CP组)，注射剂量80mg/kg/鼠［5］。按国家实验动物饲养标准喂食，在喂食30、60、90、120d 后每次取 GM 组、CK 组、CP 组各 6只小鼠进行精细胞早期微核实验，其余小鼠在喂食30、60、90、120d后每次取 GM 组、CK 组、CP 组各6只小鼠进行顶体完整率和顶体反应率实验。动物实验期间饲养条件为，室内温度22～24℃，室内湿度40%～70%，光照时间为12h，12h黑暗，动物自由取食饮水。

1.4 饲料

实验用转基因豆粕为孟山都公司(Monsanto)的抗除草剂大豆GTS40－3－2，非转基因豆粕为其亲本品种A5403，动物饲料委托广东省实验动物中心进行加工，饲料中的各种成分比例参照国家标准中实验动物配合饲料营养成分标准(GB 14924.3－2001))以玉米、鱼粉、麸皮、豆粕和小麦等为主要原料(其中豆粕比例为15%)，并添加单体矿物质和复合维生素，经混合机混匀后进行加工调制制成圆筒状，常温保存。对照组饲料中豆粕全部为非转基因豆粕，而实验组饲料中以15%的转基因豆粕代替非转基因豆粕，其余与前者相同。

1.5 实验方法

1.5.1 小鼠睾丸早期精细胞的微核出现率 参考张才［6］等实验方法并加以改进，将小鼠脱颈椎处死，迅速摘取一侧睾丸，置于加有3mL睾丸细胞分离液(Tim液)的小平皿中，去除被膜，将曲细精管剪成碎段，反复吹打后，经200目筛网过滤到5mL离心管中，以500r/min离心5min，弃上清，加Tim液洗涤细胞两次，再加1.5mL的Tim液制成细胞混悬液。取10μL细胞悬液推片，自然干燥，甲醇固定30min，凉干，用1∶9的吉姆萨－磷酸缓冲液(pH6.8)染液染色30min，蒸馏水轻轻冲洗载玻片，自然晾干。采用双盲法油镜下每只动物计数1000个早期精细胞，统计其微核(MN)细胞率，微核率以千分率表示。微核率按下式计算:早期精细胞微核率(‰)=含微核的早期精细胞数/计数的早期精细胞总数×1000。

1.5.2 小鼠精子顶体完整率的检测 参考郭名和［7］等实验方法并加以改进，颈椎脱臼处死小鼠，解剖后取双侧附睾尾置于1mL浓度为0.9%的生理盐水中，培养皿置于37℃ CO2培养箱中孵育十分钟，精子悬液2000r/min，离心10min。将精液用浓度为0.9%的生理盐水离心清洗两次，弃去上清，剩余沉淀用新鲜生理盐水适量重悬。取10μL精液置于干净载玻片上，均匀推片，每只小鼠制备两张片子。室温晾干后于95%乙醇中固定30min，自然凉干。在暗房中将载玻片置于PSA－FITC染色缸中，染色4h。取出后在暗房中用双蒸水冲洗，荧光显微镜镜检，计数500个精子中顶体形态结构完整性。顶体完整率(%)=顶体完整的精子数/总检测精子数×100。

1.5.3 精子顶体反应率的检测 参考邵佇雄［8］等实验方法并加以改进，将小鼠脱颈椎处死后，取两侧附睾尾置2mL HTF培养液中剪碎，取上述精液稀释后计数，取1×106精子，稀释至1mL;37℃ CO2培养箱内孵育1h，使精子获能;在获能精子悬液中加入10μL浓度为1mg/mL孕酮(终浓度为10μg/mL)(二甲基亚砜(DMSO)的终浓度 ＜1%)，继续在 37℃CO2培养箱孵育30min诱导顶体反应。将已诱导顶体反应后的精子悬液2000r/min，离心10min。沉淀用HTF培养液洗涤精子2遍，适量HTF培养液悬浮沉淀，混匀，取该精子悬液10μL进行精子涂片，室温晾干后于95%乙醇中固定30min，自然凉干。在暗房中将载玻片置于PSA－FITC染色缸中，染色4h。取出后在暗房中双蒸水冲洗，荧光显微镜镜检，计数500个精子中顶体反应率。顶体反应率(%)=发生顶体反应的精子数/总检测精子数×100。

1.5.4 统计分析 应用 SPSS17.0软件进行数据录入。统计分析采用方差分析，结果采用x±s表示。组间差异进行方差分析后，再用t检验，以p＜0.05为有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 抗草甘膦转基因大豆对小鼠睾丸早期精细胞微核率的影响

GM组、CK组和CP组在喂食时间分别30、60、90和120d后处死小鼠，取睾丸进行早期精细胞微核实验，图1为在光学显微镜油镜下的睾丸早期精细胞，箭头所指即为出现微核的睾丸早期精细胞。30d短期喂食实验结果经方差分析，组间采用t检验，GM组和CK阴性对照组相比，微核率没有统计学差异(p＞0.05)，CP组微核率较GM组和CK组相比，具有极显著性差异(p＜0.01)。30d急性毒理研究表明喂食抗草甘膦转基因大豆对小鼠生殖细胞染色体不会造成损伤，环磷酰胺导致小鼠生殖细胞染色体发生严重损伤，说明所选阳性对照可靠。90d长期喂食实验结果经方差分析，组间采用t检验，GM组和CK阴性对照组相比，微核率没有统计学差异(p＞0.05)，CP组微核率较GM组和CK组相比，具有极显著性差异(p＜0.01)。90d亚慢性毒理研究表明喂食抗草甘膦转基因大豆对小鼠生殖细胞染色体不会造成损伤，环磷酰胺导致小鼠生殖细胞染色体发生严重损伤，说明所选阳性对照可靠。结果如图2所示。

图1 光学显微镜1000×油镜下的睾丸早期精细胞Fig.1 Early testicular sperm cells viewed under optical microscope using a 1000×oil immersion objective

图2 抗草甘膦转基因大豆对小鼠早期精细胞微核率的影响Fig.2 Effect of GM soybean on micronucleus of early testicular sperm cells in mice

2.2 抗草甘膦转基因大豆对小鼠精子顶体形态结构的影响

实验期内，各组实验动物均未有死亡。GM组、CK组和CP组在喂食30、60、90、120d后取附睾精子进行实验，如图3示为精子经FITC－PSA染色后在荧光显微镜油镜下观察到的荧光照片与对应的相差显微照片，箭头所指为顶体异常精子，其他为正常顶体精子。如图3所示，正常精子顶体区域荧光亮，顶体与核间荧光微弱，核及核后无荧光，异常顶体精子常表现为顶体区域缺失、不完整。30d短期喂食实验结果经方差分析，组间采用t检验，GM组和CK组相比，顶体完整率无统计学差异(p＞0.05)，CP组顶体完整率较GM组和CK组相比，具有极显著性差异(p＜0.01)。30d急性毒理研究表明喂食抗草甘膦转基因大豆对小鼠精子顶体形态结构没有影响，环磷酰胺导致小鼠精子顶体形态发生异常，说明所选阳性对照可靠。90d长期喂食实验结果经方差分析，组间采用t检验，GM组和CK组相比，顶体完整性无统计学差异(p＞0.05)，CP组顶体完整率较 GM组和CK组相比，具有极显著性差异(p＜0.01)。90d亚慢性毒理研究表明喂食抗草甘膦转基因大豆对小鼠精子顶体形态结构没有影响，环磷酰胺导致小鼠精子顶体形态发生异常，说明所选阳性对照可靠。结果如图4所示。

图3 荧光显微镜油镜下的FITC－PSA荧光染色照片(1000×)Fig.3 Fluorescent dye FITC－PSA photos under oil immersion objective(1000×)

图4 抗草甘膦转基因大豆对小鼠精子顶体完整性的影响Fig.4 Effects of GM soybean on the acrosome integrity to mice sperm

2.3 抗草甘膦转基因大豆对小鼠精子顶体反应率的影响

实验期内，各组实验动物均未有死亡。GM组、CK组和CP组在喂食30、60、90、120d后取附睾精子进行实验，图5A、图5C为精子经FITC－PSA染色后在荧光显微镜油镜下观察到的荧光照片与对应的相差显微照片，如图所示，顶体完整的精子整个精子头部的顶体区表现为明亮的荧光，而发生顶体反应的精子只有赤道区有荧光标记，图5B、图5D为对应精子的相差显微照片。30d短期喂食实验结果经方差分析，组间采用t检验，GM组和CK组相比，无统计学差异(p＞0.05)，CP组顶体反应率较GM组和CK组相比，具有极显著性差异(p＜0.01)。30d急性毒理研究表明短期喂食抗草甘膦转基因大豆对小鼠精子受精能力没有影响，环磷酰胺导致小鼠精子顶体反应发生异常，说明所选阳性对照可靠。90d长期喂食实验结果经方差分析，组间采用t检验，GM组和CK组相比，无统计学差异(p＞0.05)，CP组顶体反应率较GM组和CK组相比，具有极显著性差异(p＜0.01)。90d亚慢性毒理研究表明喂食抗草甘膦转基因大豆对小鼠精子受精能力没有影响，环磷酰胺导致小鼠精子顶体反应发生异常，说明所选阳性对照可靠。结果如图6所示。

图5 荧光显微镜油镜下的FITC－PSA荧光染色照片(1000×)Fig.5 Fluorescent dye FITC－PSA photos under oil immersion objective(1000×)

图6 抗草甘膦转基因大豆对小鼠精子顶体反应率的影响Fig.6 Effects of GM soybean on the ratio of acrosome reaction

3 结论与讨论

随着全球对粮食需求加剧及基因工程技术的发展使转基因作物及其产品越来越多地进入人们的生活，转基因产品食用安全性问题在世界范围内引起广泛关注。关注的焦点是转基因产品是否具有潜在的风险如过敏性、食品毒性、导致抗生素抗性及对环境影响［9］等。哺乳动物的生殖器官睾丸对外界化学物质的作用十分敏感，在其他组织器官还未出现毒性反应之前，睾丸组织可能已经出现损害作用［10］。研究表明外界因子如壬基酚透过血睾屏障影响生精细胞、支持细胞和间质细胞的功能，干扰机体内分泌平衡［11］，从而使雄鼠生殖功能受到损害［12］。精子质量是影响雄性哺乳动物生育能力的关键因素，WHO规定把精子顶体反应率，精子膜功能完整性作为评价精子受精功能的重要指标［13］。Denise［14］等用抗草甘膦转基因大豆喂食孕鼠，亲代及子代雄鼠睾丸细胞流式检测发现，睾丸细胞总体(单倍体、二倍体和四倍体)百分数和对照组相比没有差异。唐茂芝［15］等用转基因棉籽喂食雄性大鼠，未发现大鼠睾丸组织出现明显病理损伤。张琳晗［16］等用转Bt玉米短期喂食小鼠，发现与正常对照组相比，高、中、低剂量组小鼠精子畸形率没有影响。田源［17］等用转基因番茄汁染毒小鼠，发现与正常对照组相比，各剂量转基因番茄汁染毒小鼠精子畸形率均无统计学意义。Xing［18］等用高赖氨酸转基因大米对大鼠进行三代喂食，发现未对精子各项参数造成影响。

本课题组在前期实验中，根据国家饲料标准(GB 14924.3－2001)，我们以 Monsanto 公司的抗草甘膦转基因大豆豆粕为实验材料，分别设置了转基因大豆高剂量组(15%转基因豆粕)、中剂量组(10%转基因豆粕+5%非转基因豆粕)、低剂量组(5%转基因豆粕+10%非转基因豆粕)，及非转基因大豆对照组进行昆明鼠30d和90d喂食实验，实时荧光定量PCR检测小鼠睾丸发育与精子功能相关的一些基因mRNA的表达谱变化。与非转基因大豆组相比，未发现高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠睾丸发育与精子功能相关的一些基因mRNA表达水平有显著性变化，转基因豆粕不同比例的3组之间也无差异(数据未列出)，故本文实验只设计了转基因大豆高剂量组和非转基因大豆组这两组。本课题组前期研究结果也表明，抗草甘膦除草剂转基因大豆饲料短期喂食30d和长期喂食90d均未对小鼠精子畸形率和存活率、睾丸细胞生殖周期比例、精子DNA损伤等造成显著影响［19－20］。本实验以雄性小鼠的为靶标器官，进一步分析转基因大豆对睾丸早期精细胞微核率、精子顶体完整率和顶体反应率的影响，探讨其是否会导致小鼠睾丸早期精细胞发生染色体畸变，是否影响小鼠精子质量和受精能力，从而评估喂食抗草甘膦转基因大豆对小鼠的生殖毒理学作用。抗草甘膦转基因大豆对小鼠进行30、60、90和120d喂食后检测其睾丸组织早期精细胞微核率、附睾精子顶体完整率及顶体反应率变化，发现与对照组相比，转基因大豆饲料组小鼠的睾丸组织早期精细胞微核率、精子顶体完整率和反应率均无统计学差异，表明抗草甘膦转基因大豆30d急性毒理喂食和90d亚慢性毒理喂食均不会引起小鼠睾丸早期精细胞染色体发生畸变，同样也不会对精子顶体完整性和顶体反应造成影响，即不会对雄性小鼠的精子质量和受精能力造成潜在的毒理学作用，据此和我们前期的相关研究结果都证明了抗草甘膦转基因大豆饲料30d和90d的摄食对雄性小鼠没有潜在的生殖毒理作用，不会对小鼠小鼠精子发育和功能造成影响。

［1］张丽君.转基因大豆进口对中国资源环境和食品安全的可能风险［J］.粮食科技与经济，2008，11(4):4－5.

［2］Snell Chelsea，Bernheim Aude.Assessment of the health impact of GM plant diets in long－term and multigenerational animal feeding trials:A literature review［J］.Food and Chemical Toxicology，2012，50:1134－1148.

［3］AppenzellerLaura M.Subchronic feeding study with genetically modified stacked trait lepidopteran and coleopteran resistant(DAS－Ø15Ø7－1xDAS－59122－7)maize grain in Sprague－Dawley rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47:1512－1520.

［4］He Xiaoyun.A 90－day toxicology study of transgenic lysinerich maize grain(Y642)in Sprague－ Dawley rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47:425－432.

［5］刘彤，朱蓓蕾.小鼠早期精细胞微核实验方法比较研究［J］.中国农业科技导报，2003，5(2):72－75.

［6］张才.钼及钼铜联合对小鼠肝脏、肾脏、睾丸细胞微核率的影响［J］.饲料工业，2011，32(11):17－20.

［7］郭名和.精液白细胞浓度与精子顶体完整率的相关性探讨［J］.国际检验医学杂志，2011，32(19):2265－2267.

［8］邵佇雄.壬基酚和镉离子在体外对小鼠精子顶体反应的影响［J］.中华男科学杂志，2011，17(4):318－321.

［9］Domingo J L，Bordonaba J G.A literature review on the safety assessment ofgeneticallymodified plants ［J］.Environment International，2011，37:734－742.

［10］贾庆军.环磷酰胺染毒小鼠精子形态及精细胞微核变化［J］.中国职业医学，2006，33(5):396－397.

［11］刘艳，崔金山，张玉敏，等.环境雌激素壬基酚对小鼠生精功能的影响［J］.工业卫生与职业病，2004，30(5):293－295.

［12］崔金山，张玉敏，段志文，等.双酚A与壬基酚混合染毒对小鼠生精功能的影响［J］.工业卫生与职业病，2004，30(5):289－292.

［13］杨麦贵，杨阳，黄萍，等.一氧化氮对人精子获能及顶体反应的影响［J］.西北国防医学杂志，2005，26(1):10－12.

［14］Brake Denise G.A generational study of glyphosate－tolerant soybeans on mouse Fetal，postnatal，pubertal and adult testicular development［J］.Food and Chemical Toxicology，2004，42:29－36.

［15］唐茂芝.转基因棉籽的食用安全性及对大鼠抗氧化系统影响的研究［J］.食品科学，2006，27(6):216－219.

［16］张琳晗，李赞，许超，等.转Bt基因玉米的生殖毒性评价［J］.玉米科学，2010，18(2):27－29.

［17］田源.转基因番茄防龋疫苗的致突变性和生殖毒性研究［J］.环境与健康杂志，2011，28(5):393－396.

［18］He ZX，Yang D，Wang Y，et al.A three generation study with high－ lysine transgenic rice in Sprague－ Dawuley rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2012，50:1902－1910.

［19］芦春斌，周文，刘标，等.喂食转基因大豆对子代雄鼠生殖系统的影响［J］.大豆科学，2013，32(1):119－123.

［20］芦春斌，杨冬宇，高忱，等.转基因大豆对雄性鼠生殖系统的安全性评估［J］.扬州大学学报，2012，33(1):23－27.