响应面法优化金银花中黄酮类物质提取条件

2014-09-04关炳峰郭良起李向力

食品工业科技 2014年11期

关炳峰，王永，郭良起，李向力

(河南省商业科学研究所有限责任公司，河南郑州450002)

金银花含有多种对人体有利的植物活性成分，如绿原酸、异绿原酸、木犀草素等黄酮类化合物，具有抗衰防癌、轻身健体的良好功效。黄酮类物质的提取方法有水提法、乙醇提取法、超声波提取法、酶解醇提法等［1－4］。周春晖等［5］研究了水提法的工艺条件，李荣等［6］以总黄酮得率为指标，用乙醇法进行了提取工艺优化，李晓军［7］等研究了超声波法提取对金银花中黄酮类物质的影响。总的来说，水提法节省资源，但是得率低，并且杂质比较多，后续处理困难。超声波提取法局部产生较高的温度导致活性物质丧失活性，且生产成本高，很难适应工业化大规模生产的需求，因此不适宜采用。酶法在提取的同时可能与金银花中的其他物质发生反应，而降低了活性物质的提取量，而且酶的价格也比较昂贵，限制了酶解提取法在工业生产上应用。而乙醇提取法有成本低、得率高、对环境污染小等优点。

本文以乙醇为溶剂，采用响应面法优化了金银花中黄酮类物质提取条件，为工业化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金银花(水分含量1.00%，灰分含量6.31%)由浙江省温州市瑞安九谭金银花加工基地提供，金银花干花粉碎，过40目筛，密封保存;芦丁标准品武汉市华顺生物技术有限公司;乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝均为分析纯。

SD－250涡轮式粉碎机浙江省嵊县特种粉碎设备厂;UV－265 FW型紫外可见分光光度计日本岛津公司;RE52－99旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验以干燥粉末(水分含量为1.00%)为原料，称取2.000g样品，放到50mL烧杯中，加入乙醇，在电热恒温水浴锅中恒温加热一定时间，收集上部液体，重复加热提取。将液体真空抽滤，将滤液置于离心机中以4200r/min离心30min取出，在真空旋转蒸发仪中浓缩至乙醇含量很少(以不能闻出酒精味为宜)，将浓缩液倒入50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容。

按表1条件进行提取［8］，提取后用分光光度法来测定并计算提取率，分析乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间、提取次数和提取液pH这6个因素对提取率的影响。

表1 提取条件的因素和水平表Table 1 Factors and levels of extraction

1.2.2 响应面法优化实验设计［9－14］以单因素实验确定响应面法设计实验的因素与水平，在料液比1∶15、提取次数3次、pH自然条件下，选取乙醇浓度X1、提取温度X2、提取时间X3三个因素，设计三因素二次回归旋转正交组合方案表2。

表2 二次回归正交旋转组合设计因素编码表Table 2 Factors and levels ofdual quadratic rotary combination design

1.2.3 金银花中黄酮类物质的测定准确称取干燥至恒重的芦丁标准品0.0224g于100mL容量瓶中，95%乙醇溶解，摇匀，定容。取 0、2、4、6、8mL 标准品溶液于25mL比色管中，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%氢氧化钠10mL，加水至刻度，摇匀，静置15min，在510nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线［15］。将实验中测得的吸光度直接代入该公式，可以直接得到提取液中黄酮类物质的含量。

金银花中黄酮提取得率(mg/g)=金银花总黄酮提取液冻干后的质量/金银花粉末质量

1.2.4 数据处理利用SAS软件，对设计的三因素二次回归旋转正交进行数据处理，并进行二次多元回归拟合，并考察3个因素之间的交互作用。

2 结果与分析

2.1 金银花中黄酮类物质提取单因素实验结果

选择温度60℃、料液比为1∶15、提取时间为2h、提取次数为3次，提取pH为7，研究乙醇浓度对提取率的影响。由图1可以看出，随着乙醇浓度的增大，黄酮类物质的含量不断升高。在乙醇的浓度达到60%前，黄酮类物质的得率随乙醇浓度的升高提高较快;当乙醇浓度大于60%后，黄酮类物质得率的增加速率明显变慢。因此，选择乙醇浓度为60%。

图1 乙醇浓度对提取的影响Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction

选择乙醇浓度为60%，其他条件不变，研究温度对提取率的影响。由图2可以看出，在60℃前黄酮类物质的得率随温度升高而升高，到达60℃时，黄酮类活性物质具有最高得率，而当温度高于60℃时，黄酮类物质的得率降低。当温度升高到一定程度时，金银花中黄酮类物质因温度高而发生变化，从而影响了黄酮类物质的提取。因此，选择提取温度为60℃。

图2 提取温度对提取的影响Fig.2 Effect of temperature on extraction

选择乙醇浓度为60%、温度60℃，其他条件不变，研究料液比对提取率的影响。由图3可以看出，开始时黄酮类物质得率的增长较快，而在料液比为1∶20时，增长速度明显变慢。可见在一定范围内提取溶剂的增多，可以使黄酮类物质提取率增加，但是当提取溶剂增加到一定程度时，黄酮类物质的提取已经达到饱和，提取率增长速度就会变慢。因此，选择料液比是 1∶20。

图3 料液比对提取的影响Fig.3 Effect of ratio of solid to liquids on extraction

选择乙醇浓度为60%、温度60℃、料液比为1∶20、提取时间为2h、提取pH不变，研究提取次数对提取率的影响。由图4可以看出，随着提取次数的增多，所获得的黄酮类物质是不断增多的，但是当提取次数达到3次以上时，黄酮类物质的得率增长速度变慢。可见，多次提取可以提高对金银花中黄酮类物质的提取，但是当提取次数到一定程度时，金银花中黄酮类物质的提取已经接近饱和，所以提取率的增长就会变小。因此，选择的提取次数为3次。

图4 提取次数对提取的影响Fig.4 Effect of extracting times on extraction

选择乙醇浓度为60%、温度60℃、料液比为1∶20，其他条件不变，研究提取时间对提取率的影响。由图5中可以看出，从1h开始，随着提取时间的增长，黄酮类物质的提取量增加，当提取时间到达2h后，黄酮得率开始明显降低。可见，随着提取时间的延长，对黄酮类物质的提取不利。因此，选择的提取时间为2h。

图5 提取时间对提取的影响Fig.5 Effect of extracting time on extraction

选择乙醇浓度为60%、温度60℃、料液比为1∶20、提取时间为2h、提取次数为3次，研究提取pH对提取率的影响。图6中可以看出，黄酮类物质的得率具有不规律性，当提取溶液pH为6时，黄酮类物质的得率最高，其它pH时，黄酮类物质的得率变动较大。当提取溶液的pH从7向酸碱两个方向移动时，黄酮类物质总的得率不断减少。可见，当提取溶液的pH呈现较强的酸性或碱性时，金银花中的黄酮类物质会因为pH的变化而发生一定的化学反应或本身性质发生变化，而不易被提取出来。因此，选择的提取pH为7。

2.2 旋转正交实验结果

按照三因素二次旋转正交回归设计方案，制备出23组浸提样，分别测定黄酮类物质的含量，用标准曲线y=11.088x－0.0002(R2=0.9999)计算结果。实验结果见表3:

图6 溶液pH对提取的影响Fig.6 Effect of pH value on extraction

利用SAS软件，对表3数据进行分析，剔除不显著因素和不显著的交互作用，得到黄酮类物质的含量随乙醇浓度、提取温度、提取时间的标准回归模型为:Y=128.68X0－4.39X1－5.00－4.23

2.3 回归模型的检验

利用SAS软件，对表3数据进行分析。由表4可以得知，在显著水平α=0.01时，回归方程式F检验显著，说明回归方程与实际情况拟和较好。F检验反映的是回归模型的有效性，由表4可知，回归模型达到极显著水平，表明回归模型能够较好地描述各因素与响应值的关系。

表4 回归方差各项的方差分析Table 4 Coding coefficients for the independent variable

由表 5 T－检验结果表明，X2、X3、X1X2、X1X3和X2X3的回归系数不显著，因而原方程可以简化为:Y=128.68X0－4.39X1－5.00－4.23。根据各变量的显著性检验可以得出三个单因素的主次关系:乙醇浓度＞提取温度＞提取时间。通过SAS分析得到最佳工艺:乙醇浓度为65%、提取温度为65℃、提取时间1.75h。

表5 T－检验结果Table 5 The result of T－test

2.3.1 双因素交互作用对提取量的影响由图7可见，乙醇浓度X1和提取温度X2有交互作用，在单因素对黄酮类物质提取的结果中，黄酮类物质的提取量随乙醇浓度的提高而增大;而由于乙醇浓度X1和提取温度X2有交互作用，使提取量出现一个峰值。因而提取金银花中黄酮类物质，乙醇浓度X1和提取温度X2不能升高过度。由图8可见，乙醇浓度X1和提取时间X3有交互作用。低浓度较长时间和低浓度较短时间的提取量相差不多，同一浓度随时间的延长提取量会先高后低。而提取时间过高长会影响提取量和提取物的性质。由图9可见，提取温度X2和提取时间X3有交互作用，当提取温度X2和提取时间X3都增大时，提取量也增大，当达到一定值时，提取量就有所下降。

表3 二次回归正交旋转组合设计实验安排及结果表Table 3 Testing scheme and results of dual quadratic rotary combination design

图7 乙醇浓度(X1)和提取温度(X2)对提取量(Y)的影响Fig.7 Effect of alcohol concentration and extracting temperature on extraction

2.3.2 模型的验证在乙醇浓度为65%、提取温度为65℃、提取时间1.75h、料液比是1∶20、提取次数为3次、提取pH为7条件下进行验证实验，平行3次实验，验证实验结果分别为 128.21、129.04、128.55mg/g，平均值为128.60mg/g，相对误差为0.85%，与预测值较为接近，证明响应面分析法得到的金银花中黄酮类物质提取条件是可行的。