姜争 刘彦龙 王锡山

细胞周期对于维持细胞的正常生长发育分化是必须的，其各个水平都受到多种因子的严格调控以确保其正常进行，其中去泛素化酶也是近年来发现的细胞周期的一个关键调控因子。细胞周期中许多重要的调控因子如细胞周期蛋白激酶CDKs和蛋白激酶抑制因子等均通过泛素化，进而由蛋白酶体降解。去泛素化酶可在蛋白酶体上将底物蛋白的泛素分子解离出来再循环，从而维持泛素水平与蛋白酶体功能稳定，控制细胞周期调控因子的活性和功能，这一类去泛素化酶又被称为管家去泛素化酶。有些去泛素化酶是通过调控泛素连接酶的稳定性和活性来发挥调节细胞周期的作用。去泛素化酶还可以通过影响细胞核转录因子的稳定性发挥调控细胞周期的作用。关于USP22如何调控细胞周期的机制并不明了。本文着重探讨了USP22与可能靶点之间的联系，以期初步确定USP22调控细胞周期的机制。

材料与方法

一、材料

选取哈尔滨医科大学附属三院2006至2007年间手术切除的82例结直肠癌患者的新鲜组织作为实验对象，包括癌旁黏膜82例及其相配对的腺癌82例。同时收集研究病例的临床病理资料，包括患者的年龄、性别、分化程度、肿瘤大小、浸润深度及有无淋巴结和远处转移等。

二、实验方法

1.仪器与试剂：二氧化碳(CO2)培养箱、荧光定量PCR仪、凝胶成像分析仪、水浴摇床、超纯水仪。USP22、BMI-1、c-Myc、cyclin D2、p14ARF、p16INK4a、GAPDH探针购自于美国Applied Biosystems公司。定量PCR相关试剂：RNA抽提试剂盒(上海生工)、TRIzol试剂(Invitrogen)、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems)、TaqMan®Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)。

2.USP22及其靶点的mRNA检测：采用RT-PCR法，按试剂盒操作说明书分别提取总RNA 1 μg，RNA水平(μg/ml)=稀释倍数×OD260值×40。RT-PCR反应体系：0.1 μg/μl cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，TaqMan®Universal PCR Master Mix 10 μl，加双蒸水(ddH2O)至20 μl。扩增条件：先95℃预变性10 min；接着进行40个循环，包括95℃ 15 s和60℃ 1 min。

三、统计学分析

用配对t检验 mRNA 表达差异；用One-Way ANOVA 分析各与临床病理参数间的关联性；用 Pearson coefficient 分析各基因间的关联性。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、与癌旁组织相比，USP22 mRNA在癌组织中的表达显著升高

经t检验分析，USP22mRNA在癌症组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.0001，图1)。

二、USP22及其靶点在转录水平上的关联性分析结果

去泛素化酶是近年来发现的细胞周期的一个关键调控因子。这一调控过程是极为复杂的，涉及到细胞周期的多个水平。在这里，我们首先分析了USP22、BMI-1、c-Myc、p16INK4a、p14ARF和cyclin D2 在转录水平上的关联性(表1)。统计学分析显示，USP22 mRNA的表达与BMI-1 mRNA(r=0.790，P<0.0001),c-Myc mRNA(r=0.528，P<0.0001)、cyclin D2 mRNA(r=0.657，P<0.0001)，但是与p16INK4a mRNA(r=0.103，P=0.358)和p14ARF mRNA(r=0.039，P=0.731)无关。

三、mRNA聚类分析结果

为了确定上述基因的mRNA表达特点，我们采用k-均值聚类分析。分析结果显示USP22、BMI-1、c-Myc和cyclin D2的表达呈聚集现象。按照四者的表达量可将其分为三组：高表达组16例、中表达组55例和低表达组11例。与临床资料相对比，四者的表达与AJCC的分期进展显著相关(P=0.005，图2)。

表1 82例肠癌患者mRNA转录水平上的关联性分析

注：c为肿瘤组；n为对照组

讨 论

越来越多的实验证实了BMI-1致癌基因相关的PcG途径是调节正常干细胞和癌症干细胞的主要机制[1-3]。到目前为止，很多实验结果都显示USP22和BMI-1在功能上存在很多交叉。因此，有学者提出USP22和BMI-1可能构建一个共同体来调节肿瘤的进展[4]。此外，USP22为c-Myc功能所需，而BMI-1与c-Myc一起参与小鼠T、B细胞淋巴瘤的发生。这些资料提示我们USP22、BMI-1、c-Myc三者间存在密切联系。故我们首先探讨了USP22、c-Myc和BMI-1之间的关联性。在我们的实验中，无论是在转录水平还是在蛋白水平，USP22、c-Myc和BMI-1之间均呈显著正相关。

PI3K/Akt通路广泛存在细胞中，是参与细胞生长、增殖、分化调节的信号转导通路。关于PcG蛋白参与Akt通路调节的研究少有报道。Lee JY[5]等报道在乳腺癌组织中，MEL-18与AKT的活性呈负相关；MEL-18的表达减弱乳腺癌细胞的增长，导致G1期停滞，其可能的机制为通过不依赖INK4a/ARF的方式促使Akt通路失活进而下调cyclin D和p27 KIP1。为了确认USP22是否能够调控Akt通路，我们检测并确认了USP22、BMI-1、pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)的关联性。我们发现，USP22和BMI-1均与pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)呈正相关，这提示我们USP22可直接或者通过BMI-1介导活化 Akt通路。因为PI3K可通过Akt、mTOR将有丝分裂信号传递给 p70 S6K1，使细胞周期主要蛋白如细胞周期素(cyclin D)的翻译上调，促进G1期进展，使细胞周期加速，因此我们同时检测并分析了cyclinD2与pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)的相关性。我们发现，cyclin D2的表达与pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)的表达呈明显正相关。因此，USP22调节细胞周期的机制有可能是通过cyclin D2介导Akt通路的活性。

总之，USP22、BMI-1、c-Myc、cyclin D2无论在转录水平还是在蛋白水平均呈显著相关性，并且通过k-均值聚类分析示四者表达的高低与结直肠癌的临床分期呈正相关，提示USP22、BMI-1、c-Myc、cyclin D2四者间存在调控结直肠癌进展的机制。另外，上述四者的蛋白表达与p16INK4a和p14ARF的蛋白表达无相关性，但是均与Akt的活性呈正相关，提示USP22可能是通过不依赖INK4a/ARF的方式，而通过调节Akt的活性来控制细胞周期的进展。

[1] Park IK,Qian D,Kiel M,et al.Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells.Nature,2003,423(6937):302-305.

[2] Lessard J,Sauvageau G.Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells.Nature.,2003,423(6937):255-260.

[3] Brabletz T,Jung A,Reu S,et al.Variable beta-catenin expression in colorectal cancers indicates tumor progression driven by the tumor environment.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(18):10356-10361.

[4] Molofsky AV,Pardal R,Iwashita T,et al.Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation.Nature,2003,425(6961):962-967.

[5] Zhang XY,Varthi M,Sykes SM,et al.The putative cancer stem cell marker USP22 is a subunit of the human SAGA complex required for activated transcription and cell-cycle progression.Mol Cell,2008,29(1):102-111.