王代宏，王 伟

(咸宁市中心医院普外科，湖北 咸宁 437100)

肠黏膜缺血-再灌注损伤是创伤、休克后导致多器官功能障碍综合征的重要病因学基础及中心环节。细胞异常凋亡是缺血-再灌注期间肠黏膜损伤的主要机制[1]，因此探讨肠缺血-再灌注损伤和修复的防治措施非常重要。有研究表明，参附注射液能保持血液动力学的稳定、调整免疫功能、改善组织与器官的微循环[2]。我们通过观察大鼠肠缺血-再灌注损伤时小肠组织病理学改变、细胞凋亡指数与有丝分裂活性，以探讨参附注射液对肠缺血-再灌注损伤与修复时小肠上皮的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 54只雄性健康大鼠，体重200～260g，购自武汉大学医学院动物实验中心，动物合格证号：SCXK(鄂)y20090850。术前晚禁食。大鼠被随机分为3组：对照组(n=6)、肠缺血再灌注组(n=24)和参附处理组(n=24)，后两组再分为缺血1h组、再灌注1h组、再灌注24h组和再灌注72h组，每组各6只。

1.2 方法 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg)，上腹部正中切口进腹，分离出肠系膜上动脉，肠缺血再灌注组和参附处理组用无损伤血管夹阻断肠系膜上动脉血流1h，再灌注1、24、72h，参附处理组于阻断前30min经静脉输注参附注射液(雅安三九药液公司，批号111232，速度8ml/(kg·h)，总量20ml/(kg·d)，对照组不阻断肠系膜上动脉血流，对照组与肠缺血再灌注组于阻断前30min经静脉输注等量生理盐水，整个实验过程均面罩给氧。在各个相应时间点上取动物的回肠制成标本待测。

1.3 观察指标 观察3组在各个相应时间点的组织病理学改变，测定细胞凋亡指数和有丝分裂活性。

1.3.1 肠黏膜病理学改变 每只大鼠取2cm回肠作标本，固定、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，每个标本肠黏膜组织病理损伤采用Haglund等积分法[3]。小肠绒毛高度采用光学显微镜下MPIAS-500多媒彩色病理学分析系统测定。

1.3.2 肠黏膜上皮细胞凋亡指数测定 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记实验(TUNEL)结合激光共聚焦显微镜观察小肠黏膜上皮细胞凋亡情况(试剂盒购自德国)，由于凋亡细胞染色定位于细胞核呈棕黄色，在显微镜下细胞核具有棕黄色颗粒作为凋亡细胞。凋亡指数(apoptosis index，AI)是每张切片随机取10个高位视野(×400)，每100个细胞中凋亡阳性细胞数。

1.3.3 肠黏膜上皮细胞有丝分裂活性的测定 在HE染色的肠黏膜上皮细胞间观察有丝分裂相，10个相邻肠黏膜上皮细胞间具有有丝分裂相的细胞数作为有丝分裂活性指数。

2 结 果

2.1 肠黏膜病理学变化 对照组为正常肠黏膜绒毛，缺血1h组部分肠黏膜绒毛分离和高度降低，对应参附处理组显示绒毛与腺体轻度受损，上皮下间隙扩大，毛细血管充血；肠灌注1h组绒毛脱落、暴露与分离，肠绒毛高度降低，对应参附处理组显示上皮和固有层中度分离与少许绒毛脱落，病理学变化明显好于缺血-再灌注损伤组；再灌注24h后，肠黏膜显示不规则再生的短绒毛，上皮细胞呈立方形，间质炎性细胞浸润，绒毛高度明显降低，而对应参附处理组肠黏膜病理学改变改善明显；灌注72h两组肠绒毛高度增加，接近正常肠黏膜绒毛(表1)。

表1 肠黏膜缺血-再灌注损伤后肠黏膜病理学改变

2.2 肠黏膜上皮细胞凋亡指数 对照组显示肠黏膜绒毛少量凋亡细胞，缺血1h组和再灌注1h组肠黏膜上皮细胞凋亡增加明显，参附处理组肠黏膜上皮细胞凋亡降低，仍高于对照组。肠灌注24、72h，肠黏膜上皮细胞凋亡降低明显，与参附处理组比较，这些改变差别没有统计学意义(见表2)。

表2 肠黏膜上皮细胞凋亡指数与有丝分裂活性的改变

2.3 肠黏膜上皮细胞有丝分裂活性 与对照组及参附处理组比较，缺血1h组和再灌注1h组肠黏膜上皮细胞有丝分裂活性降低明显，肠灌注24h，肠黏膜上皮细胞有丝分裂活性增加，肠灌注72h后接近正常水平，两组差别没有统计学意义(见表2)。

3 讨 论

3.1 小肠黏膜缺血-再灌注损伤 小肠黏膜缺血15min即有绒毛顶端上皮细胞损伤，持续5h几乎整个小肠壁坏死[1]。我们研究发现，缺血1h后肠黏膜绒毛分离，肠灌注1h绒毛明显脱落、暴露与分离，黏膜屏障损害，绒毛高度与有丝分裂活性降低明显。目前认为细胞凋亡是组织缺血-再灌注损伤导致细胞死亡的重要方式，在这过程中许多病理改变如凋亡基因、氧自由基、炎性细胞、细胞内和细胞间钙离子的异常分布与肠黏膜上皮细胞凋亡关系密切[4]。本研究也发现，正常小肠绒毛顶端少量细胞凋亡与小肠上皮细胞生理更新密切，肠缺血1h、再灌注1h后小肠绒毛大量上皮细胞凋亡，与肠黏膜屏障的损害程度密切相关。

3.2 小肠黏膜缺血后的修复 肠上皮细胞凋亡与增殖存在动态平衡，是保证肠黏膜稳定的重要机制[5]。我们实验证实肠再灌注24h肠黏膜上皮隐窝有丝分裂活性明显高于再灌注1h，但肠绒毛的结构并没有完全恢复。肠再灌注72h肠黏膜上皮隐窝有丝分裂活性达到正常水平，结构也接近正常肠绒毛。肠黏膜上皮细胞的修复与基因调节、细胞因子、多肽生长因子以及间质组织与上皮细胞的交互作用密切相关[6]。我们观察到肠黏膜上皮细胞凋亡和DNA碎裂在小肠黏膜缺血-再灌注1h达到高峰，再灌注24h和72h降低，凋亡细胞开始于绒毛的顶端和隐窝。这证明肠黏膜上皮细胞凋亡与大量增殖、生长失常和细胞老化有关，从而保持肠黏膜结构的稳定。

3.3 参附注射液对肠黏膜缺血再灌注损伤和修复的防治作用和可能机制 参附注射液在防治肠黏膜缺血再灌注损伤方面表现出“多靶作用”的优势[7]。临床上广泛应用于损伤、休克与多器官功能障碍综合征。我们研究发现，在参附处理组缺血1h、灌注1h肠黏膜病理学改变好于缺血-再灌注损伤组，灌注24、72h，参附注射液的保护作用逐渐减弱，这证实参附注射液能够减轻肠黏膜缺血再灌注损伤早期肠黏膜上皮细胞的病理学损害。参附处理组肠黏膜上皮细胞凋亡指数低于缺血-再灌注损伤组，说明参附注射液能够降低肠黏膜上皮细胞凋亡。与缺血-再灌注损伤组比较，在参附处理组缺血1h和灌注1h肠黏膜上皮细胞有丝分裂活性增强，在接下来的肠灌注24h后，两组肠黏膜上皮细胞有丝分裂活性均明显增加，到灌注72h达正常水平，这证实参附注射液能够增强肠黏膜上皮细胞有丝分裂活性，促进细胞的再生及修复。

肠黏膜上皮细胞凋亡在肠黏膜缺血再灌注损伤与修复中起重要作用，有效维持了肠黏膜的稳定。参附注射液能够减轻肠黏膜缺血再灌注损伤与修复过程中肠黏膜上皮细胞的病理学损害，这种保护作用在早期尤为明显，其机制可能是参附注射液能够降低肠黏膜绒毛上皮细胞凋亡、增强上皮细胞有丝分裂活性、促进肠黏膜绒毛上皮细胞的再生及修复。

[1]Coopersmith CM， O'Donnell D， Gordon JI，et al.Bcl-2 inhibits ischemia-reperfusion induced apoptosis in the intestinal epithelium of transgenic mice[J].Am J Physiol，1999，276:G677

[2]孟庆涛，夏中元，刘先义，等.参附注射液对再灌注期间肠黏膜上皮细胞凋亡的抑制[J].中国临床康复，2005，9(47):172

[3]Haglund U，Osterberg J.Local consequences of reperfusion in the gut.Pierce A and Robert T Mathie :Ischemia-Reperfusion Injury[J].Blackwell Science，Oxford UK，1999，23:65

[4]程芳洲，唐国华，李庚山，等.大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡情况及缺血预处理对其影响[J].咸宁医学院学报，2001，15(4):229

[5]耿艳霞，黎介寿，李秋荣，等.大鼠小肠缺血-再灌注损伤后隐窝细胞增殖在肠黏膜屏障损伤修复中的作用[J].肠外与肠内营养，2012，19(5):288

[6]李云胜，刘克玄，刘家欣，等.大鼠肠缺血再灌注损伤后肠黏膜差异表达蛋白质组的分离与鉴定[J].中华生物医学工程杂志，2009，15(3):170

[7]Wang Dai-Hong，He Xiao-Fei，Li Xiang-Chu，et al.Protective effect of shen-fu injection on intestinal mucosal ischemia-reperfusion injury and intestinal epithelial cells at recovery phase in rats[J].Chinese Journal of Clinical Rehabilitation，2006，10(47):202