王海英, 周启霞，宋雅琪，吴 琼，何凌峰，朱静静

(中南民族大学 生命科学学院 微生物与生物转化重点实验室，武汉 430074)

在微藻的营养成分中，多不饱和脂肪酸(PUFA)特别是二十碳五稀酸(20∶5n-3,EPA)和二十二碳六稀酸(22∶6n-3,DHA)由于具有降血压、降血脂、防治心脑血管疾病及调节免疫等功能，可以作为高级保健品的原料，同时也是许多关系到水产动物生长发育的必需脂肪酸，可提高投喂动物的生长速度和存活率[1].微藻具有生长快、适应性强、单位面积产量高等优点，其中三角褐指藻(Phaeodactytuumtricornutum)含有较高的EPA，被广泛应用于水产饵料和PUFA的生产，具有较大开发和利用的潜力[2,3].

猪粪废水的排放和再利用是一个重要的环境问题，大量研究表明：藻类对二级废水中的氮、磷等营养物质的去除效果十分显著，是一种可再生利用的生物处理技术[4,5]，常用于废水处理的藻株为绿藻属的栅藻、小球藻等，鲜见有关硅藻用于废水处理的报道.本研究以一株含有较高多不饱和脂肪酸的三角褐指为材料，探索稀释的猪粪水培养三角褐指藻的可行性，考察了三角褐指藻在猪粪废水中藻细胞生长，对猪粪废水中氮、磷的去除效果和脂肪酸组成变化.在净化猪粪水中氮、磷的同时，降低了三角褐指藻的养殖成本，为利用猪粪废水培养三角褐指藻生产工艺的建立奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

三角褐指藻来自中南民族大学生命科学院发酵实验室.其中藻种培养采用中科院水生所提供的叉培养基：0.05 g/L NaNO3, 0.005 g/L K2HPO4·3H2O, 0.1 mL/L FeCl3·6H2O, 30 g/mL海水素，40 mL/L土壤提取液和0.5 mL/L维生素B混合液(过滤灭菌).气相色谱仪(6890,美国Agilent公司)，紫外可见分光光度计(UV-6100S，上海美谱达公司).

1.2 三角褐指藻的培养和收集

将猪粪水(取自华中农业大学附近的猪场)静置24 h后进行过滤.用30 g/L盐水将猪粪水分别稀释成15, 25, 40和80倍4个梯度，以叉培养基为对照，每组3个平行，每个平行300 mL培养液，高压灭菌后以10%的接种量接种培养.培养参数设置为：(22±2)℃，连续光照，光照强度为5000 lux，无菌空气由硅胶管连接的空气过滤器引入，流速300 mL/min..在指数生长期末期离心收集藻液并冷冻干燥，低温保存.

1.3 生长曲线和污水的测定

采用血球计数板计数测定生长曲线. 污水中氨氮用纳氏试剂比色法测定，总氮用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定, 总磷用过硫酸钾氧化-钼锑抗分光光度测定[6].

污水中氨氮、总氮、总磷去除率的计算：去除率=(原始含量-残留量)/原始含量×100 %.

1.4 脂肪酸的测定

样品酯化采用三氟化硼-甲醇法，气相色谱法测定脂肪酸组成[7].

1.5 统计分析

数据采用统计软件 SPSS 10.0 进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用 LSD 和 Tukey HSD 法进行统计检验(p<0.05).

2 结果与讨论

2.1 不同稀释倍数的猪粪水中三角褐指藻的生长曲线

盐水稀释不同倍数的猪粪水中培养三角褐指藻的生长曲线见图1，图1中三角褐指藻在稀释25, 40, 80倍的初级猪粪水中生长时，无滞后期，直接进入对数生长期.随着培养时间的延长，稀释40倍和80倍的猪粪水中的细胞生长缓慢，且远远低于合成培养基中的细胞生长，可能是由于培养液稀释倍数的增加导致在三角褐指藻的生长中不能提供充足的营养物质；在稀释15倍的猪粪水中细胞的初期生长出现适应期，细胞生长密度与合成培养基的培养效果相似；而在稀释25倍的猪粪水培养液中藻细胞的生长优势较为明显，远优于合成培养基中的生长，最高的藻细胞密度是合成叉培养基的1.52倍，说明可以不向污水中添加其他任何营养成分实现三角褐指藻的全污水培养.调整猪粪废水的稀释倍数培养液中的营养物质可使三角褐指藻在猪粪废中正常生长，不同的污水稀释率会影响氮磷等营养物质的供应，而对三角褐指藻的生长产生不同的影响.

图1 同稀释倍数猪粪水中三角褐指藻的生长曲线Fig.1 The growth curves of P.tricornutum in piggery wastewater with different dilutions

2.2 三角褐指藻对不同稀释度的猪粪水的总氮的去除

三角褐指藻对不同稀释倍数猪粪水的总氮去除率结果见图2.由图2可知，稀释15倍的猪粪水总氮的去除率非常低，随着稀释倍数的增加总氮去除率增加，至稀释80倍的猪粪水去除率增加至47.83%；因为稀释倍数较低时，虽然营养物质较为丰富，但溶液的浊度变大，培养液的其他物质如一些金属元素、残留的抗生素等物质浓度较高也会抑制藻的生长，降低了对营养物质的利用.

图2 三角褐指藻对不同稀释倍数猪粪水的总氮去除率Fig.2 The removal ratio of total nitrogen by P.tricornutum in piggery wastewater with different dilutions

2.3 三角褐指藻对不同稀释度的猪粪水的氨氮的去除

不同稀释倍数的猪粪水中氨氮去除率结果见图3.由图3可见，三角褐指藻的生长可有效去除猪粪废水中的氨氮.在稀释25倍的猪粪水中氨氮的去除率达到93.19%，在其他稀释度的猪粪水中的去除率也达到50%以上，远高于总氮的去除率，微藻常可利用铵盐、硝酸盐及尿素等为氮源，三角褐指藻优先利用氮源中的氨氮进行生长，藻的生长与氨氮的利用率密切相关.

图3 不同稀释倍数的猪粪水中氨氮去除率Fig.3 The removal ratio of NH3-N by P.tricornutum in piggery wastewater with different dilutions

2.4 三角褐指藻对不同稀释度的猪粪水的总磷的去除

不同稀释倍数的猪粪水中总磷去除率见图4.由图4可见，三角褐指藻的生长对猪粪水中的磷的去除效果很理想.在稀释倍数为80, 40, 25的猪粪水中，三角褐指藻对总磷的去除率均达到了90%以上，在稀释25倍的猪粪水中达到93.19%，绿藻属的蛋白核小球藻对磷的去除率最高也只能达到77%[8]，说明硅藻属的三角褐指藻对磷的吸收能力非常强.

图4 不同稀释倍数的猪粪水中总磷去除率Fig.4 The removal ratio of NH3-N by P.tricornutum in piggery wastewater with different dilutions

2.5 稀释猪粪废水中三角褐指藻脂肪酸组成变化

在稀释25倍的猪粪水和叉培养基中培养的三角褐指藻的脂肪酸组成见图5，由图5可见，该株三角褐指藻的主要脂肪酸是C16∶0，C16∶1和C20∶5(EPA)，其中C16∶1的含量在30%以上，其次是C16∶0，在合成培养基与25倍稀释猪粪水中培养得到的EPA占总脂肪酸组成的百分数分别为13.1%和16.9%，稀释猪粪水中的EPA百分含量略高于合成培养基培养的藻；饱和脂肪酸的含量(SFA)含量和单不饱和脂肪酸(MUFA)的含量分别占到总脂肪酸组成的约30%.在猪粪水中培养的三角褐指藻的多不饱和脂肪酸(PUFA)的占到总脂肪酸组成的为23.6%，明显高于合成培养基中生长的藻的PUFA的总脂肪酸百分含量(19.6%).可见适当稀释猪粪废水的培养不影响三角褐指藻的PUFA的积累，说明用猪粪废水培养三角褐指藻获得PUFA的工艺可行.

参 考 文 献

[1] 李春颖, 仇雪梅.海洋微藻脂肪酸组成的研究进展[J].生物技术通报,2008(4):63-66.

[2] Garcí M C C , Sevilla J M F , Fernández F G A,et al. Mixotrophic growth ofPhaeodactylumtricornutumon glycerol: growth rate and fatty acid profile[J]. J Appl Psychol， 2000,12(3/5): 239-248.

[3] 刘晓娟, 段舜山, 李爱芬.有机碳源和氮源对三角褐指藻生长的影响[J].水生生物学报，2008, 32(2):252-258.

[4] 王 琴, 符笳茵, 应 月,等. 废水养殖高油微藻的研究进展[J].现代食品科技, 2013, 29(6):1441-1446.

[5] Woertz I , Feffer A, Lundquist T, et al. Algae grown on dairy and municipal wastewater for simultaneous nutrient removal and lipid production for biofuel feedstock[J]. J Environ Eng, 2009, 135(11) : 1115-1122.

[6] 王心芳, 魏复盛, 齐文启. 水和污水检测分析方法[M].4版.北京:中国环境科学出版社, 2002:210-284.

[7] 王海英,牟晓庆.城市污水培养富油蛋白小球藻的研究[J]. 中南民族大学学报:自然科学版, 2011, 30(3):38-41

[8] Wang H, Xiong H, Hui Z, et al. Mixotrophic cultivation of Chlorella pyrenoidosa with diluted primary piggery wastewater to produce lipids[J]. Bioresour Techno, 2012,104:215-220.