王殿东 赵宝彦 潘丽梅

(长江师范学院，重庆，408100) (北华大学)

人参黑斑病菌毒素纯化与结构鉴定1)

王殿东 赵宝彦 潘丽梅

(长江师范学院，重庆，408100) (北华大学)

研究了人参黑斑病菌毒素的主要化学成分、分子结构及毒素量效关系。经过乙酸乙酯萃取的粗毒素再经硅胶吸附色谱、制备液相色谱等进行分离、纯化，再经生物测定，确定了成分相对较少的人参黑斑病菌毒素的有效成分的官能团，并采用气质联机(GC-MS)的方法初步确定人参黑斑病菌毒素的主要成分为邻苯二甲酸丁酯。

人参；黑斑病菌；毒素结构

人参黑斑病是吉林省人参产区发病范围最广，危害最为严重的人参病害，严重影响人参的产量和品质。黑斑病的病原菌为链格孢属(Alternaria)真菌，该属真菌可对多种五加科植物致病[1]，目前该病致病机制尚不完全清楚。病原真菌在与植物的长期进化过程中逐渐形成了寄生性和致病性，病原菌通过产生对植物有害的致病因子(酶、毒素、激素等)使寄主植物感病。其中致病毒素是植物病害中起重要作用的一类化合物，是某些植物病害的主要发病原因，对植物组织有明显的损伤作用[2]。毒素的作用位点主要是在寄主植物细胞质膜、线粒体、叶绿体等细胞结构上，破坏细胞的膜体系，严重影响寄主的代谢，引起寄主蛋白、核酸等一系列的不良反应，导致植株生理失调，细胞死亡乃至植株枯死。目前已分离到多种病原菌的致病毒素：Cuq等从玉米大斑菌的培养滤液中分离纯化出一种称为monocerin的物质[3]；Bashan[4]从玉米大斑病菌的培养滤液中分离到结构为Gln-Ser-Gly的三肽；Walton等[5]从燕麦维多利亚病菌中提取出一种Victorin毒素[5]；杨斌等[6]在松针褐斑病菌的代谢产物中分离到一种黄色固体物质LA-Ⅱ；刘云惠等[7]在玉米大斑病菌毒素中分离到7种纯组分其中组分2是5-羟甲基-2-呋喃甲醛标准毒素；崔洋等[8]在玉米小斑病病菌C小种的毒素培养滤液中分离出毒素toxin1；周毓君等[9]从草莓灰霉病病菌毒素中分离到2种毒素的主要活性成分；赵伟全等[10]在辣椒疫霉菌中分离到电泳纯级别的毒素。这些毒素的分离纯化推动了人们对病原菌对植物致病物质的认识，同时为揭示植物病原真菌的致病机制奠定了重要的基础，有助于认识和防治植物病害。在前期的研究中，笔者通过人参黑斑病的粗毒素进行接种试验表明其对健康的人参叶片具有致病作用，初步确定病菌毒素是人参黑斑病的重要致病因子[11]。在此基础上本研究对毒素的化学成分、分子结构及毒素量效关系等进行研究，旨在揭示毒素的致病机理，为研制钝化人参黑斑病菌毒素的物质奠定科学依据。

1 材料与方法

材料：人参黑斑病菌，由北华大学病理实验室提供。

粗毒素提取：将人参黑斑病菌，按实验确定的最佳培养条件培养好后，将菌液先用4层纱布过滤，再用2层滤纸抽滤得到全毒培养滤液共2 L，用真空冷冻干燥机对其进行浓缩。将浓缩后的培养滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用旋转蒸发法减压回收乙酸乙酯近干，即获得粗毒素提取物[12]。

硅胶柱分离：将提取的粗毒素拌硅胶，放置12 h自然干燥后计算干物质质量，上硅胶柱，用石油醚装柱，以石油醚和乙酸乙酯作为流动相进行分离，收集不同部位。洗脱结束后，对上述各部分进行减压回收溶剂，分别用无菌水溶解，进行生物测定，确定有生物活性的有效部分。

高效液相色谱(HPLC)分离：将硅胶柱层析得到的有效部位的合并物质用甲醇溶解后，用0.45 μm膜过滤杂质，液相色谱流动相为70%甲醇溶液，在254、360、210 nm波长下进行HPLC制备，收集组分[13-15]。对上述制备得到的各部分进行减压回收甲醇，分别用无菌水溶解后进行生物测定，确定有效部位。

毒素结构的鉴定：将经过乙酸乙酯提取的毒素总提取物和HPLC制备的有效部位样液分别置于100 mL三角瓶中蒸干(减压蒸发)，将其甲酯化后，分别采用GC-MS进行分析，得到总提取物总离子流色谱图和有效部位总离子流色谱图，分析鉴定总提取物和有效成分的官能团的化学成分，分析毒素组分及分子结构。通过检索标准质谱图库NIST，用离子流色谱峰面积归一化法确定各组分的相对含量。①色谱条件。DB-5 30 m×0.25 mm石英毛细管色谱柱；载气为氦气；界面温度为280 ℃；进样口温度为275 ℃；柱温为60 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至275 ℃保持；流速为1.2 mL/min。②质谱条件。电离方式为电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；接口温度280 ℃；进样口温度280 ℃；扫描质量范围为33.00～450.00 amu；倍增器电压1 000 V；溶剂切割时间3.0 min。

毒素的合成及生物验证：用GC-MS分析鉴定有效部位的组成，确定毒素成分，对毒素进行合成，称取1 g邻苯二甲酸氢钾(50 mL蒸馏水溶解)加入2 mL硫酸，用50 mL乙醚提取2次，水洗2次乙醚至水呈中性，挥发乙醚。加入10 mL正丁醇，缓慢加入1 mL硫酸，回流3 h，加入20 mL乙醚，20 mL 10% NaCl溶液(饱和)，萃取。乙醚用水洗至中性，无水硫酸钠脱水，浓缩至干燥得到合成毒素邻苯二甲酸丁酯，加入无菌水溶解进行生物鉴定，观察是否同样产生病斑。

毒素含量与产生病斑的量效关系研究：配制成不同浓度(mL/L)的毒素溶液。采用针刺法将配制好的不同浓度的毒素溶液做生物测定，以产生病斑直径最大的粗毒素为阳性对照[11]，每个处理接种5片叶片，以无菌水为阴性对照，显微镜下测定病斑直径大小，计算平均值，分析毒素量与产生病斑的量效关系，显微镜下测定病斑直径大小，以DPS软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 硅胶梯度洗脱结果

将乙酸乙酯提取的粗毒素干物质4.15 g拌硅胶上样，以石油醚洗脱500 mL后，改用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1洗脱500 mL，5∶2洗脱500 mL，5∶3洗脱500 mL，5∶4洗脱500 mL，5∶5洗脱液若干。在没有出现谱带之前每250 mL收集一次洗脱液，出现谱带后将同一颜色谱带收集在一起，同时收集2谱带之间无颜色的中间带，共收集到15个不同部位的洗脱液。对这15个部位进行生物测定，结果接种8号、9号的植物叶片出现明显病斑，无菌水及其它各个回收物接种后无病斑出现，说明8号、9号显示生物活性，作为HPLC制备的样品进行进一步的分离。

2.2 HPLC分离

用高效液相色谱仪(Agilent1100)对硅胶柱分离得到的有效成分进行分离制备。将硅胶柱层析得到的8号、9号有效部位的合并物质进行HPLC分离制备，共收集6部分组分，并得到制备色谱图(图1)。对制备得到的6个部分进行生物测定。结果接种第三部分组份的植物叶脉、叶肉都有明显坏死，确定第三部分有毒性活性，第三部分出现时间为8.0～10.0 min，为2号峰，收集到的流动相体积为20 mL，是人参黑斑病致病毒素的有效部位。

2.3 毒素结构鉴定

将乙酸乙酯提取的毒素总提取物与液相色谱分离有效部位分别进行甲酯化，采用GC-MS(Agilent 6890N/5973i)进行分析，得到总提取物总离子流色谱图(图2)和有效部位总离子流色谱图(图3)，得到总提取物色谱鉴定结果，有效部位鉴定结果(表1)。

根据表2的分析结果，有效部位甲酯化后含有乙酸乙酯、丙酸乙酯、苯乙醇、醋酸丁酯、棕榈酸甲酯、邻苯二甲酸丁酯组分。乙酸乙酯为试剂峰，不是毒素成分，棕榈酸甲酯是棕榈酸的甲酯化产物，一般植物中都含有，不是毒素成分。丙酸乙酯、苯乙醇、醋酸丁酯为小分子化合物，接种后挥发较快，可能毒素作用较小，那么邻苯二甲酸丁酯成为毒素的可能性最大，其分子式为C16H22O4，结构图见图4。经生物测定发现，合成毒素可产生与毒素培养液相似的病斑，说明邻苯二甲酸丁酯为人参黑斑病致病毒素。

2.4 毒素接种量与病斑直径的量效关系

无菌水接种的叶片产生病斑平均直径为0.30 mm，接种纯毒素的叶片枯死，说明该毒素对植物有强致病作用。接种人参黑斑病毒素培养滤液和不同浓度合成毒素溶液产生病斑平均直径见表2。

表1 总提取物与有效部位甲酯化组分

图2 培养液甲酯化GC-MS总离子流色谱图

图3 有效部位甲酯化GC-MS总离子流色谱图

图4 邻苯二甲酸丁酯质谱图与结构

表2 毒素接种量与病斑直径平均值的关系

注：CK+为粗毒素；CK-为无菌水。表中数字为平均值±标准误。

由表2可以看出，毒素接种量与病斑直径无明显线性关系。加入毒素量在0.01和0.02 mL/L时产生病斑直径与接种无菌水产生病斑直径无显著差异，毒素量为0.03 mL/L病斑直径有所上升，并且随着毒素体积分数的升高病斑直径也呈递增趋势，在毒素量为0.06、0.07、0.20 mL/L时产生病斑与培养滤液产生病斑直径无显著差异，在毒素量为0.09 mL/L时病斑直径达最大值，为0.96 mm，随后随着毒素量的增加，病斑直径呈减小趋势。

3 结论与讨论

本研究将乙酸乙酯萃取的粗毒素经硅胶吸附色谱、制备液相色谱进行分离，再经生物测定确定了成分相对较少的人参黑斑病菌有效成分的官能团采用气质联机(GC-MS)的方法鉴定毒素主要成分及分子结构，初步确定为邻苯二甲酸丁酯。Gu等[16]的研究表明，邻苯二甲酸二丁酯最主要的危害在于环境激素作用，在极低的浓度下就可干扰人和动物的内分泌系统。Piersma等[17]发现邻苯二甲酸二丁酯对人和动物具有致畸、致癌和致突变作用。李佳华等[18]、Dueck等[19]的研究均表明对邻苯二甲酸二丁酯高等植物具有毒性作用。这说明本研究中分离到的邻苯二甲酸丁酯具备成为人参黑斑病致病物质的毒素条件。

采用合成的邻苯二甲酸丁酯对健康的人参叶片进行接种试验表明，邻苯二甲酸丁酯能使健康的人参叶片产生病斑。当毒素体积分数在0.03 mL/L以上时可以使健康的人参叶片发生病变，在毒素量为0.09 mL/L病斑直径达到最大值。这种毒素体积分数低时不能致病而在一定体积分数范围内随着毒素的增加病斑直径增大，而当毒素体积分数达到某一特定值后病斑直径开始下降——即致病能力的变化趋势与笔者之前采用粗毒素接种的趋势完全吻合[11]。本研究中对人参黑斑病毒素量效关系的研究采用水作为载体，而没有采用其他溶剂是因为考虑到毒素可能会与其它溶剂发生协同作用，影响试验结果。在量效关系的研究中发现毒素在水中的溶解度影响了毒素的致病效果，所以在今后的试验中对人参黑斑病毒素的载体还有待进一步研究。

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Purification and Structural Identification of Phytotoxin of Ginseng Black Spot Pathogen (Alternariapanax)/

Wang Diandong(Yangtze Normal College, Chongqing 408100, P. R. China); Zhao Baoyan, Pan Limei(Beihua University)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(1).-122～125，130

Ginseng;Alternariapanax; Toxin

1) 国家自然科学基金项目(30771733)。

王殿东，男，1979年8月生，长江师范学院生命科学学院，博士研究生。

潘丽梅，北华大学林学院，教授。E-mail:good2094@yeah.net。

2013年4月24日。

S432.1

责任编辑：程 红。

The experiment was conducted to isolate the impure toxin fromAlternariapanaxto clarify the chemical composition, molecular structure and dose-effect relationship of toxin of Ginseng black spot pathogenAlternariapanaxby silica gel adsorption chromatograph and preparative chromatography, respectively. Composition and molecular structure of the toxin was identified as butyl benzene o-dicarboxylate by Gas Chromatography-Mass Spectrometer.