王小玲 高 柱 郑 健 刘腾云 余发新

(江西省观赏植物遗传改良重点实验室(江西省科学院生物资源研究所)，南昌，330096)

四倍体刺槐扦插不定根发生的酶活性变化1)

王小玲 高 柱 郑 健 刘腾云 余发新

(江西省观赏植物遗传改良重点实验室(江西省科学院生物资源研究所)，南昌，330096)

以四倍体刺槐当年生硬枝和半木质化嫩枝插条为材料，探讨不定根发生过程中吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的变化及其与扦插生根之间的关系，揭示四倍体刺槐扦插生根机理。结果表明：IAAO和PPO是影响四倍体刺槐扦插不定根发生的2种关键酶。IAAO通过调节内源IAA(吲哚乙酸)水平来影响生根；在不定根形成过程中，硬枝插穗IAAO活性高于嫩枝；IBA处理的硬枝插穗IAAO活性高于对照，IBA处理的嫩枝插穗IAAO活性低于对照，证明內源IAA对四倍体刺槐插穗不定根的发生具有双重作用。PPO活性与插穗不定根的发生呈正相关；IBA处理可以显著提高插穗PPO活性，促进生根；不定根表达期，硬枝插穗PPO活性升高，是抑制硬枝插穗不定根发生的主要原因之一。POD活性与插穗不定根发生呈弱相关。

四倍体刺槐；IAAO活性；POD活性；PPO活性

吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)是与扦插不定根形成和生长有密切关系的3种酶[1]。IAAO能降解IAA，调节插穗体内IAA水平[2]。POD也能氧化IAA，消除体内过多的内源IAA。POD作用的某些产物也可能是不定根发生的辅助因子，促进不定根的形成[3]。PPO是一种含铜的酶，能催化酚类物质与IAA缩合形成一种有利于生根的辅助因子“IAA-酚酸复合物”[4]。然而，IAAO分子上具有与PPO相同的活性部位，具有与PPO同等的功能；POD的多种同工酶中表现出不同的性质，或具有IAAO活性，或具有PPO活性；植物体内IAAO也具有POD的性质[5]。可见，这3种酶的关系密切，不定根发生和生长与这3种酶有重要的联系。因此，研究四倍体刺槐硬枝和嫩枝扦插生根过程中这3种酶的活性变化，了解难生根树种扦插IAAO、POD和PPO活性与生根能力大小的内在联系，有助于揭示四倍体刺槐扦插生根的机理。

1 材料与方法

四倍体刺槐硬枝扦插在树液流动以前，从3年生母树剪取当年生枝条制穗，插穗直径为10～12 mm，长度为12～15 cm，剪好的插穗50根为1捆捆扎。先用5 g·L-1多菌灵溶液浸泡3 min，然后用IBA 1 g·L-1溶液浸泡6 h后[6]，分3个小区扦插。扦插深度8 cm，密度400根·m-2。IBA溶液处理前随机取5根插穗，为第0 d样品；扦插后，第15、20、25、30、35 d分别取样。

四倍体刺槐嫩枝扦插从3年生母树剪取当年生半木质化嫩枝插条制穗，每个插穗顶端留一对复叶，每个复叶留两片单叶，插穗直径为8～10 mm，长度为10～12 cm，剪好的插穗30根为一捆捆扎。先用5 g·L-1多菌灵溶液浸泡3 min，然后用IBA 1.4g·L-1溶液浸泡4 h后[6]，分3个小区扦插。扦插深度5 cm，密度以两插穗叶片不重叠为原则。IBA溶液处理前随机取5根插穗，为第0 d样品；扦插后，第5、10、15、20、25 d分别取样。

以上试验，均以清水浸泡四倍体刺槐硬枝和嫩枝插穗基部为对照(CK)。浸泡和取样时间与IBA溶液处理的插穗相同。扦插后，在规定的取样时间，每次每区随机抽取9根插穗，清水冲洗干净，迅速剥取插穗基部1 cm范围内的皮层，混合后分为3组，液氮冷冻后于超低温冰箱保存。

IAAO活性测定于530 nm波长处测定吸光度(OD)值，以每克鲜质量每小时破坏IAA的微克数表示酶活性[μg·g-1·h-1]。POD活性测定采用愈创木酚染色法，470 nm波长测定其OD值，其活性用μg·g-1·min-1表示。PPO活性测定采用邻苯二酚法，420 nm波长处测定其OD值，以每克鲜质量每分钟光密度每变化0.01为一个酶活性单位[U·g-1]。IAAO、POD和PPO活性测定参照王小玲等[7]方法。

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 16.0统计分析软件进行数据处理，LSD法比较差异显著性。

2 结果与分析

2.1 四倍体刺槐扦插IAAO活性变化

以往研究表明[8]，四倍体刺槐硬枝扦插生根的3个主要时期为：愈伤组织形成期(0～20 d)、不定根形成期(根原基诱导期)(20～30 d)、不定根表达和伸长期(30 d以后)；嫩枝扦插生根的3个主要时期为：愈伤组织形成期(0～10 d)、不定根形成期(10～20 d)、不定根表达和伸长期(20 d以后)。

四倍体刺槐硬枝扦插，经1 g·L-1IBA处理的插穗，IAAO活性变化趋势为先升高后降低(图1)。IBA处理的插穗活性变化幅度大于对照，处理插穗IAAO活性在扦插后0～30 d急剧升高，30～35 d迅速下降；对照插穗IAAO活性在扦插后0～20 d急剧升高，20～35 d缓慢降低。整个生根过程中，处理插穗IAAO活性明显高于对照，但方差分析表明，两者之间插穗IAAO活性变化的差异水平不显著(F=1.819，P=0.207 2)。四倍体刺槐嫩枝扦插，经1.4 g·L-1IBA处理的插穗(图2)，在根原基诱导期和不定根表达与伸长期，插穗IAAO活性低于对照，两者之间IAAO活性差异水平不显著(F=0.29；P=0.602)。IBA处理和对照插穗IAAO活性高峰出现在根原基诱导期，此时，IAAO活性最高，促进嫩枝根原基诱导，随即IAAO活性降低，有利于不定根从愈伤组织伸出。

图1 四倍体刺槐硬枝扦插IAAO活性变化

图2 四倍体刺槐嫩枝扦插IAAO活性变化

2.2 四倍体刺槐扦插POD活性变化

四倍体刺槐硬枝扦插，经1 g·L-1IBA处理和对照插穗POD活性呈递增趋势，生根不同时期POD活性变化明显(图3)。IBA处理插穗POD活性在扦插第15 d后始终高于对照，但处理和对照插穗之间POD活性差异不显著(F=1.623，P=0.231 4)。四倍体刺槐嫩枝扦插(图4)，经1.4 g·L-1IBA处理的插穗在扦插前10 d，POD活性直线下降，10～15 d大幅度上升，15～25 d缓慢下降，扦插后第15 d形成的一个高峰，显然参与了根原基的诱导；对照插穗POD活性持续下降，下降的幅度比处理插穗大。整个生根过程中IBA处理的插穗POD活性比对照高，两者之间POD活性差异水平显著(F=6.562，P=0.028 3)。可见，嫩枝扦插POD活性与不定根发生的关系大于硬枝。

图3 四倍体刺槐硬枝扦插POD活性变化

图4 四倍体刺槐嫩枝扦插POD活性变化

2.3 四倍体刺槐扦插PPO活性变化

四倍体刺槐硬枝扦插(图5)，经1 g·L-1IBA处理和对照插穗PPO活性呈现先下降后上升的趋势，处理插穗PPO活性高于对照，处理与对照之间插穗PPO活性差异水平极显著(F=13.593，P=0.004 2)。愈伤组织形成期，PPO活性相继下降，推测由于愈伤组织的形成，伤口得到愈合，因此，PPO活性维持一定的水平或略有下降；根原基诱导期和不定根表达与伸长期(20～35 d)，PPO活性逐渐上升。

图5 四倍体刺槐硬枝扦插PPO活性变化

四倍体刺槐嫩枝扦插(图6)，经1.4 g·L-1IBA处理的插穗PPO活性显著高于对照(F=9.211，P=0.012 6)。愈伤组织形成期，插穗PPO活性降低，催化生成的“IAA-酚酸复合物”较少，有利于愈伤组织的形成，处理和对照插穗PPO活性分别降低了8.49%和30.62%；根原基诱导期，插穗PPO活性升高，参与合成了大量的生根辅助因子“IAA-酚酸复合物”，有利于根原基的发育，扦插第15 d有一个明显的峰值，处理插穗PPO活性升高显著大于对照(F=20.321，P=0.004 1)；不定根表达与伸长期，插穗PPO活性降到最低，对照插穗PPO活性明显低于IBA处理，说明不定根伸长期，已不需要大量生根辅助因子。

2.4 四倍体刺槐扦插IAAO、POD和PPO活性与生根的关系

四倍体刺槐扦插生根率与扦插起始期和根原基诱导期插穗体内IAAO(图7)、POD(图8)和PPO(图9)活性关系显示：扦插起始期，生根率与IAAO和PPO活性呈现强相关性，相关系数分别是0.74和0.63；与POD活性呈现非常弱的负相关，相关系数是-0.06。生根率与扦插起始期IAAO、POD和PPO活性的决定系数R2分别是0.541 2、0.003 8和0.390 9，说明扦插前插穗体内IAAO、POD和PPO活性参与不定根的发生和发展的可能性分别为54.12%、0.38%和39.09%。根原基诱导期，虽然生根率与IAAO、POD和PPO活性均呈现正相关，但相关程度不一样。生根率与PPO活性呈现非常强的相关性，相关系数是0.89；与IAAO活性呈现中度相关，相关系数是0.57；与POD活性呈现弱相关，相关系数是0.33。生根率与根原基诱导期IAAO、POD和PPO活性的决定系数R2分别是0.322 4，0.108 5和0.800 1，这也说明在根原基诱导期，IAAO、POD和PPO活性参与不定根的发生分别有32.24%、10.85%和80.01%的可能性。由此表明，四倍体刺槐插穗生根率与IAAO和PPO活性的关系密切；扦插起始期插穗体内IAAO活性的高低比根原基诱导期插穗体内IAAO活性的高低对生根率的影响更大，即插穗自身状态的IAAO活性对生根率的影响更大；根原基诱导期插穗体内的PPO活性高低比扦插起始期插穗体内PPO活性的高低对生根率的影响更大，即不定根诱导过程中提高插穗体内PPO活性，对生根有利。

图6 四倍体刺槐嫩枝扦插PPO活性变化

图7 四倍体刺槐扦插IAAO活性与生根率的关系

3 结论与讨论

IAAO是IAA分解代谢的关键酶，能氧化分解內源IAA，调节植物体内的IAA水平，保证植物的正常生长发育。Gyana[9]和刘永军等[10]研究认为，难生根树种插穗IAAO活性高，IAA被破坏较多，向基部输送的IAA浓度降低，对诱导生根不利。相反，姚瑞玲等[12]研究难生根的邓恩桉和易生根的尾巨桉表明，邓恩桉插穗IAAO活性较低，对IAA浓度调节作用和不定根的诱导及形成作用不明显；而尾巨桉插穗中IAAO活性高，降低了插穗IAA浓度，诱导不定根的形成。四倍体刺槐扦插研究发现，硬枝插穗不定根形成过程中IAAO活性明显高于嫩枝，与生根过程中硬枝插穗內源IAA浓度高于嫩枝的水平一致；经IBA处理的硬枝插穗IAAO活性较高，能分解代谢更多的內源IAA，IAA浓度降低，促进硬枝插穗生根[8，11]，此结果支持了姚瑞玲等[12]的研究结论；而经IBA处理的嫩枝插穗IAAO活性较低，分解代谢的內源IAA减少，IAA浓度升高，促进嫩枝插穗生根，与Gyana[9]的研究结论一致。可见，IAAO通过调节四倍体刺槐插穗体内IAA浓度，影响扦插生根，且內源IAA在四倍体刺槐扦插不定根形成过程中表现出双重作用。

图8 四倍体刺槐扦插POD活性与生根率的关系

图9 四倍体刺槐扦插PPO活性与生根率的关系

POD在植物扦插生根过程中有2个重要的生理功能：一是参与生长素的代谢，起着与IAAO相同的作用，氧化消除体内过多的IAA；二是POD活性升高，促使插穗木质化程度提高，抑制生根。四倍体刺槐硬枝扦插POD活性持续升高，嫩枝扦插POD活性总体呈现下降，推测是由于硬枝插穗POD活性升高，促使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，插穗木质化程度提高，生根率降低。研究还发现，硬枝和嫩枝扦插，经不同质量浓度IBA处理的插穗POD活性都高于对照，推测POD参与了插穗生长素代谢，氧化分解內源IAA，使得内源IAA在适宜的浓度范围内促进生根，此研究结果也支持了Metaxas et al.[13]，Syros et al.[14]和Koti et al.[15]的研究结论。还有研究认为[16]，POD作用的某些产物可能是不定根发生与发育所必须的辅助因子，不定根诱导期插穗POD活性增强是生根能力的标志。四倍体刺槐嫩枝扦插，根原基诱导期插穗POD活性明显升高，促进不定根的形成，也是四倍体刺槐嫩枝扦插生根高于硬枝的原因之一[6]。

PPO可以催化生长素IAA和酚类物质代谢，综合形成一种有利于愈伤组织形成和不定根形成的辅助因子“IAA-酚酸复合物”。本研究中，四倍体刺槐嫩枝插穗PPO活性高于硬枝，IBA处理的硬枝和嫩枝插穗PPO活性高于对照，相关性分析表明，四倍体刺槐扦插生根与插穗PPO活性呈正相关，支持了Satisha等[17]和秦永建等[18]报道的易生根插穗PPO活性较高的结论。李仲芳等[19]研究报道，PPO的另一个作用是催化插穗愈伤组织中的多酚物质氧化成醌，醌再转化为羟醌，羟醌进一步聚合，生成黑色素，致使愈伤组织褐变、老化、腐烂，抑制了不定根的表达。由此推测，四倍体刺槐硬枝插穗不定根表达与伸长期PPO活性升高，抑制了不定根的表达；嫩枝插穗不定根表达与伸长期PPO活性降低，促进了不定根的表达，也是四倍体刺槐嫩枝扦插较硬枝容易的原因之一。而有关四倍体刺槐插穗PPO活性和酚类物质的相互关系，还有待于深入研究。

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Enzymes Activity in Adventitious Roots Formation of TetraploidRobiniapseudoacaciaCuttings/

Wang Xiaoling, Gao Zhu, Zheng Jian, Liu Tengyun, Yu Faxin(Key Laboratory of Horticultural Plant Genetic and Improvement of Jiangxi Province, Institute of Biological Resources, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330096, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(1).-19～22，89

TetraploidRobiniapseudoacacia; IAAO activity; POD activity; PPO activity

1) 国家自然科学基金项目(30972352)、江西省科学院省级重点实验室开放基金项目(2011-KLB-5)。

王小玲，女，1979年10月生，江西省观赏植物遗传改良重点实验室(江西省科学院生物资源研究所)，助理研究员。

余发新，江西省观赏植物遗传改良重点实验室(江西省科学院生物资源研究所)，研究员。E-mail：fxyu2000@126.com。

2013年4月1日。

S718.43； S792.26

责任编辑：任 俐。

With tetraploidRobiniapseudoacaciaof hardwood and softwood cuttings, the indole-3-acetic acid oxidase (IAAO), peroxidase (POD) and polyphenoloxidase (PPO) activity, as well as the correlations between IAAO, POD, PPO activity and rooting rate of cuttings during rooting process, were conducted to elucidate the rooting mechanism of tetraploidR.pseudoacacia. IAAO and PPO activity are closely related to the development of adventitious roots in tetraploidR.pseudoacacia. The effect of IAAO activity on rooting is regulated by the endogenous IAA. During rooting process, IAAO activity of hardwood cuttings is higher than that of softwood cuttings. IAAO activity of hardwood cuttings treated by IBA is higher than that of controls. IAAO activity of softwood cuttings treated by IBA is lower than that of controls, demonstrating the dual roles of endogenous IAA in tetraploidR.pseudoacaciacuttings. PPO activity is positively correlated to the rooting rate. IBA shows significant improvement in PPO activity to improve rooting performance in tetraploidR.pseudoacaciacuttings. One of the important reasons that the rooting rate of hardwood cuttings is lower than the softwood cuttings is its higher PPO activity in the initiation and elongation phase of adventitious roots. POD activity has relatively weak influence on the development of adventitious roots.