王志颖， 蒋冬花， 宋迤明， 刘琴英， 齐育平

(浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004)

白蚁链霉菌(Streptomycestermitum)ACT-2菌株拮抗物质的分离纯化、解析及活性分析

王志颖， 蒋冬花*， 宋迤明， 刘琴英， 齐育平

(浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004)

从浙江省金华市郊水稻田土壤中筛到1株拮抗水稻白叶枯病菌的白蚁链霉菌(Streptomycestermitum)ACT-2菌株。该菌株的菌体和发酵液对水稻白叶枯病菌均表现出较强的拮抗能力；水稻盆栽生防试验结果表明：对水稻白叶枯病有较好的防效，生防效果最高可达80.80%。通过分步萃取、硅胶柱层析、凝胶柱层析等步骤，分离纯化获得拮抗活性物质，对目标物进行核磁共振氢谱分析和质谱分析，通过解析与比对该目标物为Aloesaponarin II(1-甲基-3,8-二羟基蒽醌)，分子式为C15H10O4。以氯霉素为对照，测定纯化的Aloesaponarin II对水稻白叶枯病菌拮抗活性，结果表明Aloesaponarin II具有较强的抗菌活性，半抑制浓度为IC50=19.2 μg/mL，但较氯霉素弱(半抑制浓度为IC50=0.39 μg/mL)。

白蚁链霉菌；拮抗物质；Aloesaponarin II；半抑制浓度

农用抗生素因具有高效、低毒、特异性强、易分解等特点，日益受到世界各国相关研究人员的重视，逐渐成为生物农药的重要组成，如农抗120、井冈霉素、春雷霉素、中生菌素等，在植物病害防治上已被广泛应用[1-5]。放线菌作为产生农用抗生素的重要菌种被筛选和研究，不断有新的抗生素结构被发现和解析[6-9]。本实验室自金华市郊区水稻田土壤中筛选获得1株白蚁链霉菌(Streptomycestermitum)ACT-2菌株，其菌体和发酵液中活性成分对白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)P6生理小种有良好的抑制作用，经过抑菌稳定性分析得知：该拮抗活性物质热、光稳定性良好，可适应一定范围内的酸、碱环境[10]。本文对该拮抗活性物质进行了分离纯化，并进一步解析了该物质的结构，测定了半抑制浓度等，以期为水稻白叶枯病菌的防治提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 供试菌株 水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)P6生理小种，由浙江师范大学化学与生命科学学院遗传实验室提供；白蚁链霉菌(Streptomycestermitum)ACT-2菌株，分离自浙江金华郊区水稻田土壤，保存于本实验室和中国典型培养物保藏中心(CCTCC，保存编号：CCTCCCM 2011008)。

1.1.2 培养基 高氏一号培养基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO40.01 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.5，用于ACT-2菌株的培养；牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，用于XooP6生理小种的培养。

1.2方法

1.2.1 发酵液制备 配制高氏一号种子培养液2 L、发酵培养液35 L，灭菌后备用。从划线活化的高氏一号固体培养基ACT-2菌株菌落上刮取少量的孢子，接入装有高氏一号种子培养液的摇瓶中(装液量50 mL/250 mL)，180 r/min 28 ℃摇床培养36 h，作为种子液[10]。按2%接种量将种子液接入发酵培养液中，180 r/min、28 ℃恒温摇床培养72 h。将发酵完成的发酵液通过双层纱布过滤，去除菌丝团和杂质颗粒。

1.2.2 拮抗活性物质的分离纯化 ①萃取剂的筛选：按照极性由低到高，分别选取石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇作为萃取溶剂，分步萃取发酵液中拮抗活性物质。萃取完成，分别汇集萃取液，旋转蒸发仪60 ℃、30 r/min蒸干，用甲醇溶解萃取物质，回收。以XooP6生理小种为指示菌，牛津杯法分别测定4种萃取剂萃取成分的抑菌活性，设置甲醇作为对照组，实验结果重复3次；②硅胶柱层析初步分离：将甲醇溶解的萃取物质烘干后称量；选取200～300目的硅胶，按照硅胶质量∶样品量=30∶1的比例称取硅胶装柱；萃取物质用甲醇溶解后，按硅胶质量∶样品量=3∶1的比例混匀，用旋转蒸发器30 r/min、45 ℃旋蒸20～30 min，蒸干硅胶中的甲醇，使硅胶完全干燥；将已经完全干燥且与样品充分吸附的硅胶通过漏斗慢慢上样，使样品均匀装填在层析柱内，保证样品与分离硅胶接触面水平、均匀。选取石油醚、二氯甲烷、甲醇作为洗脱剂，按照极性由小到大，设置洗脱梯度顺序为：石油醚∶二氯甲烷=1∶0，100∶1，50∶1，25∶1，10∶1，5∶1，1∶1；二氯甲烷∶甲醇=1∶0，100∶1，50∶1，25∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1。洗脱液每20 mL收集1次，编号。每个梯度洗脱至洗脱液完全无色，则换下一梯度洗脱。将洗脱液分别由旋转蒸发器45 ℃、30 r/min蒸干，甲醇溶解；分别通过硅胶薄层层析验证，将含有相同极性成分的洗脱液收集在一起，蒸干，甲醇溶解回收。牛津杯法测定抑菌活性；③凝胶柱层析纯化拮抗物质：称取35 g Sephadex LH-20凝胶，装填层析柱，甲醇冲洗柱中凝胶2～3次。加入甲醇至凝胶面上1～2 cm位置，旋紧旋塞，保持液面高度。将硅胶柱层析初步分离得到的含有拮抗物质的混合物以甲醇溶解，用胶头滴管逐滴加入到层析柱中。上样完毕后，轻轻旋开塞子，控制甲醇滴落流速，保证流速为0.5 mL/min，并观察样品进入凝胶的速度。待样品完全进入凝胶后，缓慢加入甲醇，保持流速，直至样品带出现分层。当凝胶中被洗脱样品不同流速的成分色带已经完全分开，而且洗脱速度最快的成分距层析柱底部约为10 cm时，打开旋塞全速洗脱。收集洗脱液。将洗脱液分别由旋转蒸发器45 ℃、30 r/min蒸干，甲醇溶解。通过硅胶薄层层析，将得到样品分别用不同极性的展开剂展开验证，确定回收成分是否单一。将已经完全纯化的拮抗物质25 ℃静置48 h，使之结晶。牛津杯法测定各组分的抑菌活性。

1.2.3 拮抗活性物质结构分析 ①核磁共振氢谱分析：称量2.0 mg结晶以氘带DMSO作为溶剂，溶解均匀后装入核磁管中，1H NMR在Brucker Avance 400 MHz型核磁共振波谱仪上完成，TMS为内标，1H NMR的观测频率为400.13 MHz，实验采用标准脉冲序列，实验温度为室温，获得氢谱图；②质谱分析：称量1.0 mg结晶，以甲醇(分析纯)溶解，在英国卡拉托斯公司MS50型质谱仪上测试，离子源温度220 ℃，进样温度350 ℃，电子能量70 eV，加速电压8 kV，采用直接进样方式，获得ESI-MS谱图。

1.2.4 半抑制浓度的测定 以氯霉素作对照，将Aloesaponarin II和氯霉素作一系列稀释，测定对XooP6生理小种的半抑制浓度。

2 结果与分析

2.1萃取剂的筛选

分步萃取后，以牛津杯法分别对石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇等4种萃取剂的萃取物质进行对XooP6生理小种抑菌作用实验，结果乙酸乙酯萃取相具有抗菌活性，在牛津杯中加入200 μL萃取物质的甲醇溶液，抑菌圈直径约为26.40 mm(图1)。

图1 乙酸乙酯相萃取物质对白叶枯病菌的抑制作用(左)和甲醇对照(右)Fig.1 The inhibition zone of the extractive matter of the ethyl acetate to Xoo race P6 (left) and the contrast was dealt with by methanol (right)

2.2硅胶柱层析初步分离结果

梯度洗脱后，共收集25组洗脱液，按照1～25号依次编号(表1)。分别汇集极性相同的组分，45 ℃、30 r/min旋蒸蒸干，甲醇溶解。用牛津杯法检测各组洗脱液对XooP6生理小种的抑制作用。结果拮抗活性物质存在于16～18号洗脱组分中，在牛津杯中加入200 μL洗脱活性物质的甲醇溶液，对XooP6生理小种抑菌圈直径约为29.00 cm(图2左)；16～18组洗脱剂为纯的二氯甲烷。

表1 不同梯度洗脱液洗脱组分

2.3凝胶柱层析分离纯化结果

将二氯甲烷洗脱得到的物质通过LH-20凝胶柱层析，在层析柱中出现2条色带分层；甲醇洗脱，收集2个组分，分别标号组分①和组分②。经硅胶薄层层析验证，组分①为少量的混合物，组分②为单点。向牛津杯中分别加入200 μL组分①和组分②的甲醇溶液，结果组分②为抑菌成分，对XooP6生理小种抑菌圈直径约为31.33 cm(图3中)。

图2 二氯甲烷洗脱物质对白叶枯病菌的抑菌作用(左)及甲醇对照(右)Fig.2 The inhibition zone of the elution ingredient of the methylene dichloride to Xoo race P6 (left) and the contrast was dealt with by methanol (right)

图3 组分①(左)、组分②(中)和甲醇(右)对白叶枯病菌的抑菌作用Fig.3 The inhibition zone of the elution ingredient ① (left) ② (Mid) and the contrast methanol (right)to Xoo race P6

将组分②的甲醇溶液于25 ℃静置48 h获得结晶，精密天平称量，拮抗活性物质结晶约为15.0 mg。10倍放大镜下观察，结晶呈针状或簇状，表观形状不规则，颜色呈黄色，有轻微抗生素味道，无其他刺激性气味(图4)。该结晶不溶于石油醚，微溶于二氯甲烷和氯仿，易溶于丙酮、甲醇、DMSO等高极性有机溶剂。

图4 白蚁链霉菌(Streptomyces termitum)ACT-2菌株发酵液中纯化的拮抗活性物质结晶(10×)Fig.4 The crystal of antibacterial ingredient extracts from Streptomyces termitum strain ATC-2 (10×)

2.4拮抗活性物质结构解析

2.4.1 氢谱图 称取2.0 mg结晶，以氘带DMSO作为溶剂，溶解均匀后装入核磁管中，以TMS为内标，1H NMR的观测频率为400.13 MHz，获得氢谱图(图5)。由图5分析可知：1H NMR(400.13 MHz，d6-DMSO)：7.72(t，J=8.0 Hz，1H)，7.63(d，J=1.8，1H)，7.45(d，J=8.0 Hz，1H)，7.32(d，J=8.0，1H)，7.04(d，J=1.8 Hz,1H)，2.69(s，3H)。

2.4.2 质谱图与分子量 称量1.0 mg结晶，以甲醇(分析纯)溶解，在英国卡拉托斯公司MS50型质谱仪上分析，获得EI-MS质谱图(图6)。

由图6分析可知，EI-MS：253.1([M-1]-)，分子量为254.1。

图5 拮抗活性物质的1H NMR氢谱图Fig.5 1H NMR of the antibacteral ingredient

图6 拮抗物质电子轰击质谱图Fig.6 The ESI-MS spectrograms of the antibacterial ingredient

2.4.3 拮抗活性物质的结构 经与文献比对[11-13]，该拮抗活性物质为Aloesaponarin II(1-甲基-3,8-二羟基蒽醌)，其结构如图7所示。

图7 Aloesaponarin II的结构

2.5AloesaponarinII的体外抗菌活性

图8 不同浓度Aloesaponarin II和氯霉素对Xoo P6生理小种的抑菌活性Fig.8 Antimicrobial activities of aloesaponarin II and Chloromycetin against Xoo race P6 at different concentrations

将Aloesaponarin II和氯霉素作一系列稀释，测定对XooP6生理小种的半抑制浓度。结果见图8，Aloesaponarin II具有较强的抗菌活性，半抑制浓度为IC50=(19.2±0.89) μg/mL，但较氯霉素弱，最低抑制浓度为IC50=(0.39±0.04) μg/mL。

3 讨 论

通过发酵获得白蚁链霉菌ACT-2菌株的发酵液，按照萃取剂的极性由低到高分步萃取，通过牛津杯法测定拮抗物质所在相，以确定最有效的萃取剂；将萃取物质通过硅胶柱层析初步分离，再通过LH-20凝胶柱层析的精细分离，获得纯的拮抗活性物质；在适宜的条件下，使之结晶；将结晶成分分别通过核磁共振仪和质谱仪分析获1H NMR氢谱图和EI-MS质谱图，通过比对解析得知该物质为Aloesaponarin II(1-甲基-3,8-二羟基蒽醌)。以氯霉素作对照，测定了Aloesaponarin II对XooP6生理小种的半抑制浓度。

在国内外多篇报道中，Aloesaponarin II因具有较高的生物活性而被作为基础骨架用于半合成，其半合成衍生物具备各种医药功能和其他结构活性。该类型骨架是杂环类结构，是蒽醌骨架为基础形成的衍生物。有研究显示，该类型物质对细胞的无序增殖具有抑制作用，同时对疟疾具有一定的治疗功能[14-15]。

目前，国内外已发现可以合成Aloesaponarin II及结构类似物的多种微生物和植物，并对其功能和活性进行了较为深入的研究[12]。本研究中，Aloesaponarin II产生于白蚁链霉菌中，并对XooP6生理小种具有高效的抑制作用，该物质在白蚁链霉菌中的合成尚属首次发现。

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Solation,Purification,Analysis,BioactivitiesAnalysisofAntagonisticSubstanceinStreptomycestermitumStrainACT-2

WANG Zhi-ying, JIANG Dong-hua, SONG Yi-ming, LIU Qin-ying, QI Yu-ping

(Coll.ofChem. &LifeSci.,ZhejiangNormalUni.,Jinhua,Zhejiang, 321004)

AStreptomycestermitumstrain ACT-2 with antimicrobial activity against paddy white leaf wilt (Xanthomonasoryzaepv.oryzae) (Xoo) race P6 was screened from rice field soil in the suburb of Jinhua. Thalamus of strain ACT-2 and its fermentation both possessed with fairly strong antimicrobial activity toXoorace P6. The best biocontrol effects of the fermentation broth of strain ACT-2 onXooin experiments in pot cultivated paddy reached as high as 80.80%. In this study, step-by-step extraction, silica gel column chromatography, gel column chromatography, and other steps, and obtained an antagonistic active substance by isolation and purification. Structural determination was made by1H NMR and EI-MS analyses. The targeted substance was Aloesaponarin II (1-methyl-3, 8-dihydroxyl-anthraquinone), with the molecular formula C15H10O4by analyses and comparison. The antimicrobial activity of purified Aloesaponarin II againstXoorace P6 was tested taking chloromycetin as a control. The results showed that Aloesaponarin II possessed fairly strong antibiotic activity, its semi-inhibition concentration was IC50=19.2 μg/mL, but weaker than that of chloromycetin (IC50=0.39 μg/mL).

Streptomycestermitum; antagonistic substance; Aloesaponarin II; IC50

浙江省“重中之重”学科“现代农业生物技术与作物病害防控”开放基金(2011KFJJ013)；2012年度校级青年基金项目(KJ20120040)

王志颖 女,硕士，助理实验师。研究方向为应用微生物学。Tel:0579-82288003，E-mail:zy798@zjnu.cn

* 通讯作者。女，教授，硕士生导师。研究方向为微生物学、植物病理学。Tel:0579-82283832,E-mail:jdh@zjnu.cn

2013-08-07；

2013-09-12

Q939.92

A

1005-7021(2014)04-0053-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2014.04.010