伊惠霞, 孟存仁

(新疆医科大学第一附属医院检验中心， 乌鲁木齐 830054)

长期以来临床微生物检验均依靠检验人员手工操作进行细菌接种，由于操作人员之间的差异，无法标准化，影响了后期培养的效率和结果的准确性，也使操作人员面临着感染的风险[1]。近年来全自动微生物标本接种仪相继问世，使标本接种速度加快，可减少系统误差和偶然误差，培养后单个菌落分辨率较高，减少了再次分纯，提高了检出率，缩短了检测周期[2]。为评价PREVL Isola全自动微生物标本接种仪对常见标本的接种效果，本研究对该接种仪阳性检出率、菌落生长情况、结果报告时间等进行观察，并与手工接种的效果进行比较，现报道如下。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 标本来源 收集2013年1-3月在新疆医科大学第一附属医院就诊的住院病人各类标本共700分，包括痰液标本200份，尿液标本200份，咽拭子标本100份，支气管吸出物100份，血培养阳性标本100份。标本严格按本实验室标本采集手册的要求留取，所有病人均在次日再次留取同样标本接种培养，2次留样按1份标本进行统计。

1.1.2 仪器和试剂 PREVL Isola全自动微生物标本接种仪、VITEK-2 Compact全自动微生物分析系统均为法国生物梅里埃公司产品。血琼脂平板、巧克力平板(含万古霉素)购自迪景公司，中国兰平板由OXOID公司干粉培养基按说明书配制而成。痰液标本消化液为OXOID公司产品。

1.1.3 质控菌株 质控菌株包括大肠埃希氏菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)，均来源于中国药品生物制品鉴定所。

1.2接种及培养

1.2.1 接种方法 (1)痰液及支气管吸出物接种：痰标本中加入消化液(1∶1)，震荡后放置30 min待其完全消化，如标本量不够，再加生理盐水至仪器要求液量，混匀后上机接种，分别接种于血平板、巧克力平板(含万古霉素)和中国兰平板。(2)尿液标本接种：将标本混匀后取仪器要求液量上机接种，分别接种于血琼脂平板和中国兰平板。(3)咽拭子接种：在无菌试管内加入10 mL无菌生理盐水，将咽拭子浸泡其中30 min，震荡2～3次，每次2 min。试管上机接种，分别接种于血平板、巧克力平板(含万古霉素)和中国兰平板。(4)血培养阳性标本接种：用无菌注射器从血培养瓶抽取10 mL培养液注入无菌试管，上机接种，分别接种于血平板和普通琼脂平板。

1.2.2 培养及菌落计数 上述所有标本同时用传统手工法接种以作比较，严格按照《全国临床检验操作规程》(第3版)[3]进行操作。标本接种后，将接种有呼吸道标本的血平板和巧克力平板放入5% CO2培养箱，其余平板放入普通培养箱，35℃培养18～24 h后观察各平板菌落生长情况，如菌落生长不良或未生长，继续放至48 h再观察。对经手工法和仪器法接种后培养结果不符的标本，再次进行培养以确认。尿液标本按规程要求进行菌落计数，换算成每毫升中的菌落数(cfu/mL)，革兰氏阳性菌计数≥104cfu/mL为有意义菌,革兰氏阴性菌计数≥105cfu/mL为有意义菌。

1.3菌种鉴定及药敏试验所有标本培养后若可疑菌单个菌落较多且分辨率高，可直接上机鉴定，若单个菌落不易区分，则进行分离纯化后用VITEK-2 Compact全自动细菌鉴定和药敏分析系统进行菌株鉴定和药敏试验。按CLSI(2010)标准[4]进行结果判断。

1.4交叉污染试验分别将含较多量大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的痰液标本各1份，放置在样品架1号位置，其余9个位置均放置无菌盐水代替样品接种并培养，观察有无交叉污染及携带污染。

1.5质量控制将ATCC25922、ATCC29213质控菌株用生理盐水稀释成0.5麦氏单位浓度，用接种仪接种于血琼脂平板，培养18～24 h后观察单个菌落生长情况，并与标准进行比较。不同分区中的单个菌落数在标准要求的范围内为合格。

1.6统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计学分析,率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1质控菌株生长情况质控菌株经仪器接种后菌落生长情况与标准菌株基本一致，其中5～8区单个菌落数为15～65个, 质量评分为5～7分，符合仪器的质量控制要求。

2.2交叉污染试验结果含大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的痰液标本分别培养出了较多量的相应菌株，而其后的9份无菌盐水均未培养出细菌。

2.3培养阳性率及检出阳性时间5种标本经自动接种仪接种后培养24 h及48 h后有意义菌的检出率(阳性率)均高于传统手工法接种，总的阳性率亦高于传统接种法(χ2值分别为6.69、5.02,P均<0.05)，相同接种方法培养24 h和48 h的阳性率无统计学差异(χ2值分别为0.14、0.56,P均>0.05)，见表1。

表1 不同样本2种接种方法培养阳性率/%

注：与手工法比较，*P<0.05。

2.4200份痰液标本的培养结果仪器法有菌生长98份，其中生长1种菌、2种菌、3种及以上菌的份数均高于手工法(χ2值分别为10.51、17.74、15.88,P均<0.01)，见表2。手工法培养出的细菌仪器法均培养出，结果一致，无漏检；而仪器法培养阳性的标本中有19份经鉴定认为有意义的菌株而手工法未培养出。仪器法培养24 h后单个菌落较多，除5份需分纯外，其余均可直接上机鉴定，而手工法有17份单个菌落数过少，需分纯。2种接种法单个菌落的生长情况见图1。

表2 200份痰液标本培养结果比较/份

图1 2种接种法单个菌落的生长情况(痰液)

左图：手工法接种的血平板 右图：仪器接种的血平板

2.5200份尿液标本培养结果仪器法培养有73份生长细菌，其中革兰氏阳性球菌23 份，革兰氏阴性杆菌30份，混合2种以上菌20份，有意义菌的检出比例与手工法比较无统计学差异(χ2值分别为2.40、1.13,P均>0.05)，但革兰氏阴性菌中有7份仪器法较手工法高1个数量级，革兰氏阳性菌中有3份仪器法较手工法高1个数量级，见表3。

表3 200份尿液标本培养结果比较/份

2.6血培养阳性的标本转种培养结果100份血培养阳性标本经接种仪初次接种培养阳性率为93%(93/100)，经再次接种培养后阳性率为100%；手工法初次培养阳性率为82%(82/100)，未培养出来的11份标本经涂片检查，菌量较少，主要为革兰氏阳性球菌(9份)，另外2份为革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性杆菌。

2.7咽拭子标本培养结果100份标本中仪器接种法培养出有意义菌18株(阳性率18%),手工法培养出13株(阳性率13%)，该13株鉴定结果和标本来源均与仪器法一致，另外5例患者经再次留取标本培养，结果和仪器法一致。

2.8支气管吸出物接种效果100份标本2种接种方法均有87份生长细菌，经初步鉴定仪器法检出有意义菌43株，手工法检出37株，该37株菌中有1株仪器法未检出，而仪器法阳性的标本中有7株手工法未检出。仪器法43株菌中有27株单个菌落较多，可直接上机鉴定，手工法16株满足直接上机要求，仪器法有11份标本可较手工法提前24 h报告结果。

3 讨论

细菌接种培养是进行后期鉴定和药物敏感试验的基础，接种的好坏直接影响培养的阳性率、鉴定的准确性和临床报告的发放时间。以接种环接种是经典的接种方法，对于含菌量多的标本(如痰液、粪便等)常采用分区划线的方法以获得单个菌落。但手工法对操作人员的要求较高，要做到严格的无菌操作，在分区划线的每一步都要用酒精灯、电炉等对接种环灭菌，存在火灾等隐患[5]，同时接种效率低，操作人员与标本接触暴露时间较长，健康风险较高。生物梅里埃公司的PREVL Isola全自动微生物标本接种仪采用一次性的微量移液器吸头吸取液体标本接种，再用一次性的涂布器在培养基表面旋转涂抹，由于涂抹过程中菌量越来越少，逐步形成单个菌落[6]。本实验中仪器法接种的平板，单个菌落的形成明显优于手工法接种，多数标本初次培养后即获得足够单个菌落，可直接上机鉴定，可提前24 h发出临床报告。

本研究中5种标本仪器法阳性率均高于手工法，主要是由于仪器接种采用吸样器定量吸样，而标本均为处理后的液体标本，细菌分布均匀。而手工法采用接种环，接种量不标准，有时可能取不到有菌组织，此外在接种环灼烧后未充分冷却的情况下，标本中的细菌可能会因高温而死亡，导致培养阴性。特别是痰液标本较为粘稠，如不充分液化，往往会取不到有意义的成分[7]。咽拭子标本由于细菌粘附在棉丝中，如不用液体浸泡，不能充分接种到培养基上。因此采用接种仪接种漏检率低，容易标准化。

尿液标本的培养结果表明，接种仪接种培养后单个菌落分离明显优于手工接种，菌落容易计数，其中10份标本手工法计数结果均明显低于仪器法1个数量级，造成低于临床判断值，与Glasson等[8]的研究相符。血培养标本由于部分标本菌量较少，手工法转种不容易生长，尤其是革兰氏阳性菌营养要求较高，更易造成假阴性[9]。由于咽拭子标本临床在取材时感染组织在拭子一侧端，接种人员若用拭子直接接种，有可能感染组织不能接种上，导致假阴性，而仪器法由于标本的液体化处理，可将细菌从棉拭子上洗脱下来，均匀地接种上去。

全自动微生物标本接种仪的使用可以明显地提高接种效率，节省人力，方法容易标准化，更多地避免人为因素的影响，减少生物因素对操作者健康的危害，缩短检验报告时间。其存在的主要缺陷是检验成本相对较高，对一些标本接种前的处理仍然比较繁琐，对于固体类标本如粪便等如处理不好，残渣会堵塞吸头造成无法吸样等[10-11]。因此其临床应用领域及方法仍有待于进一步研究和改进。

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