韩娜娜， 金 华， 马翔宇， 刘 艳， 张 洁

(1新疆医科大学附属肿瘤医院妇科, 乌鲁木齐 830011; 2中山大学药学院， 广州 510006)

新疆地区宫颈癌的发病率及病死率一直居全国之首，近年来有逐渐年轻化趋势。新疆医科大学附属肿瘤医院10 a病案统计显示，收治的各类恶性肿瘤中宫颈癌占18.9%，位居第1位。每年新收治的子宫颈癌约500例，其中维吾尔族妇女占70%～80%，特别是南疆维吾尔族妇女宫颈癌患病人数在全国少数民族中占第1位[1]。这种民族聚集性高发的现象提示，除环境致癌因素外，可能还存在遗传易感性，因此有必要了解新疆维吾尔族妇女宫颈癌中与发病相关的细胞分化、增殖及凋亡相关调节蛋白的表达情况。近年来研究发现，P53、胰岛素样生长因子-I (insulin like growth factors，IGF-I)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、 Bcl-2和Bax与肿瘤的侵袭、转移和预后不良密切相关[2]。本研究选取新疆宫颈癌高发人群维吾尔族妇女宫颈病变样本资源，在mRNA和蛋白表达水平对P53、IGF-I、VEGF及凋亡相关因子Bcl-2和Bax在宫颈癌中的表达、分布为切入点，探讨新疆维吾尔族妇女宫颈癌的高发机制，并试图为本地区宫颈癌的早期诊断、判断预后寻找有效的生物学指标。

1 材料与方法

1.1研究对象选取2012年10月-2013年6月新疆医科大学附属肿瘤医院妇科收治的维吾尔族妇女浸润性宫颈癌(Invasive Cervical Cancer，ICC)组织38例作为宫颈癌组，以同期新疆维吾尔族妇女良性病变行子宫切除患者正常或者慢性宫颈炎组织32例作为正常对照组。年龄27～58 岁，中位年龄(48.32±7.65)岁。纳入病例时排除已接受过肿瘤手术切除或放化疗的患者，同时排除患有子宫切除或骨盆放射治疗史、其他恶性肿瘤以及呼吸系统、心血管和代谢性疾病等其他严重疾病的患者。所有组织标本均经病理学确诊，并且患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂及仪器Trizol 试剂(美国 Invitrogen公司)，荧光定量 PCR 试剂盒、dNTPs 及逆转录酶 (北京康润生物公司)，ABI Prism 7500 荧光定量 PCR 仪(美国 ABI 公司)。P53、IGF-I、VEGF、Bcl-2和Bax特异性单克隆抗体(Santa Cruz 和Anbobio公司)，酶标二抗和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)。

1.3实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)检测

1.3.1 引物设计合成 由NCBI基因库获知人类表皮生长因子受体-2(HER-2)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、表皮细胞生长因子(EGF)、IGF-I、VEGF和内参照GAPDH基因的序列，按照原则设计和扩增6种基因的引物，引物由北京康润生物合成。实时荧光定量PCR引物的序列见表1。

表1 引物设计序列

1.3.2 RNA提取、cDNA合成和荧光定量PCR反应 采用Trizol法提取RNA后逆转录合成cDNA，按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作，反应体系: 扩增条件：94℃ 2 min热变性后, 进行40个循环，94℃ 30 s, 55℃30 s, 72℃延伸(1 min/kb),72℃延伸7 min。荧光定量PCR仪扩增并采集数据，根据数据分别绘制2种样品的标准曲线。

1.4蛋白免疫印迹选择两组在RTFQ-PCR结果中差异有统计学意义的基因，对其蛋白的表达含量进行测定。取宫颈组织0.5 g，剪碎加入细胞裂解液, 匀浆裂解40 min，12 000 r/min离心5 min，收集上清液进行蛋白定量 (BCA法)。取40 μg总蛋白进行12.5%变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移，丽春红S染色，封闭非特异性的结合位点，TBST洗膜，加入预测蛋白的一抗孵育1 h。TBST 洗膜后加入结合有辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔的IgG 二抗孵育1 h，化学发光、显影、定影，以GAPDH蛋白作为内参照。

1.4统计学处理采用SPSS17.0软件进行统计学分析，资料分析采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1荧光定量结果与正常对照组(mRNA表达数据为1)比较，宫颈癌组患者宫颈组织中IGF-I、VEGF 和Bcl-2表达均有不同程度的升高，P53、Bax表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2蛋白免疫印迹结果与正常对照组比较， 宫颈癌组患者宫颈组织中VEGF、Bcl-2表达均有不同程度的升高，P53、Bax表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，而两组IGF-I蛋白表达差异无统计学意义，见图2、3。

2.3两组Bcl-2/Bax值比较结果与正常对照组比较，在mRNA和蛋白质水平，宫颈癌组Bcl-2表达均明显升高，而Bax表达均明显下降，Bcl-2/Bax值显著升高，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

3 讨论

肿瘤的发生、发展是多种因素作用的结果，有内因也有外因，在肿瘤的发生发展过程中总要涉及细胞的增生分化、凋亡、细胞周期的调控、信号传导以及肿瘤中血管的生成等，与很多细胞因子有关，有的参与细胞的增生分化；有的参与细胞周期的调控；有的与血管的生成有关，或者同时有多种功能并相互作用。

本研究选取与肿瘤生长、浸润、转移密切相关的P53、IGF-I、VEGF 和Bcl-2 、Bax 5个因子，检测了其在维吾尔族妇女宫颈癌组织中的表达变化，从整体水平筛查与子宫颈癌发生相关的分子生物学指标，对维吾尔族宫颈癌的早期诊断及筛选治疗靶点等具有重要的意义。

P53基因位于17号染色体，是重要的抑癌基因，分为野生型和突变型，野生型抗肿瘤的作用主要是阻止G1/G0期，使细胞不能进入S期，从而抑制细胞的增殖[3]。突变是人类肿瘤最常见的基因改变之一，在200多种不同的肿瘤中有50% 的肿瘤带有P53 基因突变,P53 基因的缺乏还能导致早期大量肿瘤的发生。齐朝阳等[4]报道了P53 基因突变及P53 蛋白过量表达与宫颈癌预后的关系。在一定的条件下，P53 基因是“基因卫士”，而在条件改变后，又可以转化为“基因杀手”。也就是说，P53基因发生突变，可导致稳定蛋白不能完成抑制细胞增殖的作用，促进恶性转化，肿瘤侵袭性增强，使得P53基因由抑癌基因转化为原癌基因，突变的P53失去抑制肿瘤细胞生长的功能，从而促进肿瘤的发生[4]。本研究使用荧光定量PCR(RTFQ-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)技术检测宫颈癌组织及正常宫颈组织中的P53在mRNA和蛋白表达水平，发现差异均有统计学意义(P<0.05)。表明P53基因突变在宫颈癌的发生、发展中起重要作用。

IGF-I调控肿瘤的可能途径是抑制凋亡。细胞凋亡，又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)，受各种凋亡基因的调控，包括内源性和外源性2种机制。IGF-Ⅰ是一类具有促进细胞增殖、分化以及血管形成等多种生物活性的多肽生长因子，其与多种肿瘤的恶性转化和侵袭转移有关[5]。 有研究显示，IGF-I可以明显提高肿瘤细胞中血管内皮生长因子( VEGF )的表达, 促进肿瘤血管的形成及肿瘤的生长、转移； ICG-I在促进肿瘤新生血管形成和肿瘤生长转移中起重要作用[6]，而阻断这些环节有可能成为治疗宫颈癌新的靶点之一。本研究表明,在mRNA表达水平，IGF-I在宫颈癌患者宫颈组织中表达升高，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。在蛋白水平表达中，两组IGF-I表达比较差异无统计学意义。

VEGF是一种与血管内皮细胞特异性结合的肝素结合糖蛋白，是目前已知的作用最强的促血管形成因子之一，也是肿瘤细胞分泌的血管形成因子中最重要的一种[7]。其能促进肿瘤血管生成，增强微血管通透性，增加肿瘤细胞氧和营养物质的供给，并为肿瘤细胞脱落和基质扩散创造条件。 目前研究发现VEGF在肿瘤组织中高表达，不但促进肿瘤的血管形成，并且与宫颈癌等多种肿瘤的发生、转移和预后密切相关[8]。本研究结果显示，与正常对照组比较，VEGF在宫颈癌患者宫颈组织中表达升高，在mRNA和蛋白表达水平中差异均有统计学意义(P<0.01)，证实VEGF与宫颈癌关系密切。

Bcl-2是Bcl-2基因家族中的原癌基因之一，包括凋亡前体蛋白及生存前体蛋白成员，对内源性细胞死亡途径至关重要，可以抑制肿瘤细胞的凋亡，与其他癌基因如P53等共同控制着细胞的生长、分化、增生和凋亡[9]。而Bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素C的释放，诱导凋亡发生。本研究分别检测了Bcl-2和Bax这2种凋亡关键因子，发现与正常对照组比较，在mRNA和蛋白水平，Bcl-2在宫颈癌组织中的表达均明显升高，而Bax的表达均明显下降，Bcl-2/Bax值显著升高(P<0.05)。其在多种肿瘤细胞内呈高表达，而促凋亡因子Bax呈低表达。由于细胞死亡的易感性受控于胞质内Bcl-2和Bax间的平衡，Bcl-2/Bax比值增大使细胞凋亡过度抑制，导致肿瘤细胞以绝对的优势获得生长，并对凋亡信号不再敏感，这种“一边倒”的生长模式打破了正常细胞的凋亡机制，使得肿瘤细胞不断发展、恶化[10]。

研究表明，恶性肿瘤的浸润转移是一个多步骤、渐进累积的复杂过程，在此过程中机体和细胞发生了许多重要改变，如细胞增殖、细胞外基质降解、肿瘤细胞黏附、细胞迁移、肿瘤血管形成等，它也是转移中的肿瘤“分子进化”的过程[11]。随着研究的深入，人们将揭示出P53、IGF-I、VEGF及凋亡相关因子Bcl-2和Bax在恶性肿瘤疾病发生发展过程中具体作用机制，探讨其与宫颈癌的关系及可能存在的差异，对阐释新疆维吾尔族妇女宫颈癌的早期诊断和治疗提供有力的理论依据。本研究临床例数尚少，其关系还需进一步的大量临床研究加以佐证。

参考文献：

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